沉默KLF4表達對人肝星狀細胞HSC-LX2生物學行為的影響

李濤 牛麗娟 劉文宣 楊磊 李曼 曹丹丹 彭亂順

·論著·

沉默KLF4表達對人肝星狀細胞HSC-LX2生物學行為的影響

李濤 牛麗娟 劉文宣 楊磊 李曼 曹丹丹 彭亂順

目的 篩選有效沉默KLF4基因表達的siRNA，觀察KLF4基因沉默對人肝星狀細胞HSC-LX2生物學行為的影響。方法 設計并化學合成針對人KLF4基因的3對siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，轉染人肝星狀細胞HSC-LX2，以轉染非特異siRNA作為陰性對照。采用實時熒光定量RT- PCR(Real-time RT-PCR )和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表達情況，篩選出沉默KLF4效果最好的1個siRNA,將其轉染入HSC-LX2后，用MTT法檢測KLF4沉默對HSC-LX2增殖的影響。采用ELISA法檢測細胞培養上清中的轉化生長因子1 (transforming growth factor，TGF-1)、白介素1(interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達情況。結果 Real-time RT- PCR和western blot均顯示siRNA3沉默效果最好。故后續試驗均采用siRNA3沉默KLF4的表達。MTT實驗結果顯示，在轉染siRNA3，12 h、24 h和48 h后，細胞活力出現明顯下降。ELISA結果顯示，轉染siRNA3，48 h以后，TGF-β1、TNF-α、IL-1β表達量也明顯降低。結論 siRNA3可有效沉默KLF4基因表達，KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖，影響其生物學行為，使細胞中的促進膠原表達的三種細胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表達量下降。

人肝星狀細胞；KLF4；轉化生長因子β1；腫瘤壞死因子α；白介素1

肝纖維化過程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是其核心環節。各種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的HSCs，導致其生物學行為及功能變化，引起肝纖維化[1]。因此，如果能夠抑制HSCs的行為和功能變化，就可以減輕甚至逆轉肝纖維化。KLF4是Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成員，具有調節某些細胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[2]。KLF4是否會對HSCs的細胞生物學行為產生影響，目前還缺乏此方面的研究。本研究觀察沉默KLF4表達是否可以抑制HSCs的行為和功能變化，減少其致纖維化的細胞因子轉化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素1(interleukin-1，IL-1)的分泌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肝星狀細胞HSC-LX2購自中南大學湘雅醫院細胞中心；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購自美國GIBCO公司；Liprofectamine 2000、Trizol reagent購自美國Invitrogen公司；SYBR Green Real-Time試劑盒購自北京百泰克公司；M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；TGF-β1,IL-1β，TNF-α ELISA試劑盒購自上海ExCellBio 公司；兔抗人KLF4、兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG購自美國Rockland公司。

1.2 方法

1.2.1 沉默人KLF4基因siRNA序列的設計:參考Genebank中人KLF4基因序列，依據siRNA設計原則選取三條可能的序列作為目標序列。同時設計一條與人KLF4 mRNA無同源性的siRNA作為陰性對照。交由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。見表1。

表1 siRNA序列

1.2.2 細胞培養:在37℃，5%CO2培養箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培養基常規培養HSC-LX2細胞。當細胞生長至合適匯合度時用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養，待細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.3 siRNA轉染細胞:采用細胞懸液法進行轉染，于轉染當日，將對數生長期HSC-LX2細胞制成細胞懸液。根據lipofectamine 2000的Protocol分別配置A、B液。A: 250 μl Opti-MEM+5 μl siRNA，室溫靜置5 min,B: 250 μl Opti-MEM+5 μl Lipfectamine 2 000混合，室溫靜置20 min。將6×105個細胞/孔細胞懸液與轉染混合物分別加入35 mm的小皿中，培養液補齊體積至1.5 ml。 5% CO2,37℃培養箱培養，12 h后換液。分別于轉染后24 h和48 h提取細胞RNA和蛋白檢測KLF4沉默效果以及細胞生物學行為檢測。

1.2.4 Real time RT-PCR檢測HSC-LX2中KLF4 mRNA表達:轉染siRNA 24 h后用PBS清洗細胞，每孔加入1 ml Trizol，充分裂解，將裂解液轉至EP管中，加入200 μl氯仿；4℃，12 000 r/min離心15 min，把上層無色液相移入新的EP管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置30 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，洗滌沉淀；4℃，5 000 r/min離心3 min，倒出液體；室溫晾干，加入DEPC 水20 μl溶解。將細胞總RNA 2 μg，采用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒進行反轉錄，使用SYBR Green Real-Time試劑盒，對反轉錄所獲得的cDNA進行Real time RT-PCR檢測，選取2 μl cDNA于20 μl反應體系中進行反應，反應在Rotor-GeneTM 6000(Corbett)中進行，循環條件為94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s 共35個循環。以GAPDH作為內參基因，采用Primer 3.0軟件，設計所需片段的擴增引物，由華大基因公司合成與純化，序列如下:人KLF4上游引物序列：5’-ATCTTTCTCCACGTTCGCGT-3’下游引物序列：5’-GGAAGTCGCTTCATGTGGGA-3’；人GAPDH上游引物序列：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’下游引物序列：5’-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT -3’。每個樣本重復3次，取平均值為Ct值，用儀器自帶軟件進行熒光定量分析，計算出△Ct值，采用相對定量2-ΔΔCt法比較目的基因mRNA的表達變化。

1.2.5 Western blot法檢測HSC-LX2中KLF4蛋白表達:轉染siRNA 48 h后用PBS清洗細胞，加入適量RIPA裂解液，用細胞刮收獲細胞裂解物，移入EP管；離心，12 000 g,15 min，取上清液加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min，取上清待用。取細胞總蛋白80 μg，經10% SDS-PAGE凝膠120 V電壓進行電泳分離，之后電轉移至PVDF膜上，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉(0.05%TBST配制)中封閉1 h，分別加入兔抗人KLF4 (1∶500稀釋)，兔抗人β-actin(1∶3 000稀釋)孵育PVDF膜，4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。利用TBS配制的紅外染料標記的二抗 IRDye800 Anti-Rabbit IgG(1∶15 000稀釋)孵育PVDF膜，室溫1 h。TBS洗膜3次，每次10 min。利用Odyssey掃描儀對PVDF膜進行掃描顯影并保存圖像。

1.2.6 MTT法測定細胞活力變化:收集對數期細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度104/ml，加入96孔板，每孔加入100 μl，邊緣孔用無菌PBS填充，5% CO2，37℃孵育，過夜培養，轉染干預結束后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)，置于培養箱中繼續培養4 h。之后終止培養，吸去孔內培養液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、轉染試劑、培養液、MTT、二甲基亞砜)。細胞活力(%)=(實驗組A490/對照組A490)×100%。

1.2.7 ELISA法檢測HSC-LX2培養液中TGF-β1、TNF-a和IL-1β的表達:按照試劑盒要求，將細胞培養液1 000 g離心10 min，收集上清用于檢測。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl，37℃溫育2 h。 棄去液體，每孔加檢測溶液A工作液100 μl，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，洗板3次， 每孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，37℃，避光顯色，每孔加終止溶液50 μl，終止反應，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度值。根據樣品值，由標準曲線查出相應的濃度。

2 結果

2.1siRNA對HSC-LX2細胞KLF4的沉默效果 三條siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)以及陰性對照NcsiRNA分別轉染HSC-LX2細胞24h后，應用Real-timeRT-PCR檢測HSC-LX2中KLF4的mRNA表達情況。應用2-ΔΔCt法比較KLF4mRNA在各組HSC-LX2中的表達情況。以NcsiRNA組為對照組，則siRNA1組、siRNA2組和siRNA3組相對于對照組的KLF4mRNA的表達分別是(0.695±0.034)、(0.602±0.046)和(0.313±0.033)(P<0.05)。可見，siRNA3組對KLF4mRNA的沉默效果最好。采用相同方法轉染HSC-LX2細胞后48h，應用westernblot法檢測HSC-

LX2中KLF4的蛋白表達情況。與內參蛋白β-actin相比，3對siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)組KLF4 蛋白表達分別是(0.614±0.046)、(0.586±0.043)和(0.322±0.031)，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與mRNA的結果類似，siRNA3組對KLF4 蛋白的沉默效果最好。故后續實驗均采用siRNA3沉默KLF4的表達。見表2，圖1。

組別KLF4mRNA(2-ΔΔCt)KLF4蛋白(protein/β?actin)對照組1．006±0．0120．912±0．032siRNA1組0．659±0．034?0．614±0．046?siRNA2組0．602±0．046?0．586±0．043?siRNA3組0．313±0．033?0．322±0．031?

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1westernblot檢測轉染三種siRNA48h后HSC-LX2中KLF4的蛋白表達結果

2.2KLF4沉默對HSC-LX2細胞活力的影響siRNA3轉染HSC-LX2細胞后，同對照組(細胞活力定義為100%)比較，MTT實驗結果顯示，在12h、24h和48h，siRNA3組細胞活力分別降為(75.56±3.56)%,(52.35±2.34)%和(50.14±2.41)%(P<0.05)。見表3。

組別12h24h48h對照組100100100NcsiRNA組101．25±1．35100．69±1．22101．56±2．31siRNA3組75．56±3．56?52．35±2．34?50．14±2．41?

注：與NcsiRNA組比較，*P<0.05

2.3KLF4沉默對HSC-LX2細胞上清液細胞因子分泌的影響siRNA3轉染HSC-LX2細胞48h后，收集細胞培養液，采用ELISA試劑盒檢測，結果顯示與對照組比較，TGF-β1表達量降到(52.42±8.14)pg/ml,TNF-α表達量下降到(35.16±4.11)pg/ml，IL-1β表達量下降到(41.34±5.73)pg/ml，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組別TGF?β1TNF?αIL?1β對照組178．28±20．3148．41±5．4380．15±6．24siRNA3組52．42±8．14?35．16±4．11?41．34±5．73?

注：與NcsiRNA組比較，*P<0.05

3 討論

RNA干擾現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程[3]。細胞中的雙鏈RNA特異性的核酸酶Dicer將雙鏈RNA裂解成大約21個核苷酸組成的siRNA，然后siRNA作為媒介引起特異性地降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應基因轉錄后的表達，啟動基因沉默機制。RNA干擾是目前相對成熟的靶基因沉默技術，可以高效、特異和持續的沉默細胞內靶基因的表達。雖然理論上任何21個核苷酸的mRNA序列都可以設計作為siRNA序列，但是他們的沉默效率相差很大。造成這樣差異的原因很多，包括mRNA二級結構的修飾，結合能的大小等[4]。如果mRNA的二級結構非常復雜，則siRNA很難與其結合，則會嚴重影響siRNA的干擾效率。因此，針對靶基因的有效、特異的siRNA序列的選擇是決定沉默效率的關鍵環節[5]。本研究中我們依據siRNA設計原則，設計了針對人KLF4mRNA序列從909到1 702位點的3個可能的序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)作為目標序列。同時設計一條與人KLF4mRNA無同源性的siRNA作為陰性對照。Real-timeRT-PCR結果顯示siRNA1組、siRNA2組和siRNA3組相對于對照組的KLF4mRNA的表達都有明顯下降，其中siRNA3組對KLF4mRNA的沉默效果最好。同樣，westernblot的結果與Real-timeRT-PCR結果類似。所以，篩選出沉默KLF4效果最好的siRNA3。

KLF4在細胞的增殖、分化以及凋亡等方面發揮重要的調節作用[6]。根據細胞組織學類型的不同，KLF4起到促進或者抑制增殖的作用[7]。例如在結直腸癌，子宮頸癌，卵巢癌，胰腺導管癌，肺癌，膀胱癌，胃癌等的表達是降低的。而在乳腺癌，皮膚鱗狀細胞癌等的表達卻是增加的。并且，在肝細胞癌中的報道目前還存在爭議[8]。所以，本部分研究沉默HSC-LX2中的KLF4表達，觀察其對HSC-LX2增殖的作用。結果顯示KLF4沉默可以抑制HSC-LX2的增殖活化，故可能減輕肝纖維化。HSC-LX2在肝纖維化過程中可以表達很多細胞因子，促進纖維化的進展。例如TGF-β1、TNF-α、IL-1β等，這些細胞因子在纖維化的發生以及炎性反應的持續方面發揮了重要的作用。TGF-β1是目前公認的最重要的致纖維化因子[9]。研究顯示抑制TGF-β1的表達，可以明顯改善纖維化動物模型的纖維化程度。TGF-β1基因敲除鼠與正常對照鼠比較，在慢性肝損傷中ECM的合成明顯減少[10]。雖然在肝臟中kupffer細胞，膽管細胞等都能分泌TGF-β1，但是HSC-LX2自分泌的TGF-β1在肝纖維化中的作用更加明顯[11]。本研究顯示KLF4基因沉默可以明顯減少HSC的TGF-β1分泌。TNF-α和IL-1β是重要的促炎因子，研究顯示減少TNF-α的表達，可以顯著改善各種原因導致的動物模型的肝損傷程度[12]。此外，IL-1β可以保護TGF-β1 和TNF-α不被蛋白酶水解，調節其生物活性和生物利用度，增加局部的炎性反應，因此促進慢性肝纖維化[13]。本部分研究也顯示TNF-α和IL-1β的表達也有明顯的減少，說明KLF4基因沉默可以減少HSC的TNF-α和IL-1β分泌，減少炎性反應，從而減輕肝臟的纖維化程度。

綜上所述，通過沉默KLF4表達，可以抑制HSC-LX2的增殖，影響其生物學行為，使細胞中的促進膠原表達的三種細胞因子TGF-β1、TNF-α及IL-1表達量下降，減輕肝纖維化程度，為肝纖維化的防治提供了新的靶點。

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4Sciabola1S,CaoQ,OrozcoM,etal.ImprovednucleicaciddescriptorsforsiRNAefficacyprediction.NucleicAcidsResearch,2013,41:1383-1394.

5YoshinariK,MiyagishiM,TairaK.EffectsonRNAiofthetightstructure,sequenceandpositionofthetargetedregion.NucleicAcidsRes,2004,32:691-699.

6FerralliJ,Chiquet-EhrismannR,DegenM.KLF4αstimulatesbreastcancercellproliferationbyactingasaKLF4antagonist.Oncotarget,2016,7:45608-45621.

7HsuHT,WuPR,ChenCJ,etal.HighCytoplasmicExpressionofKrüppel-likeFactor4IsanIndependentPrognosticFactorofBetterSurvivalinHepatocellularCarcinoma.IntJMolSci,2014,15:9894-9906.

8YinX,LiYW,JinJJ,etal.Theclinicalandprognosticimplicationsofpluripotentstemcellgeneexpressioninhepatocellularcarcinoma.OncolLett,2013,5:1155-1162.

9LiangC,BuS,FanX.SuppressiveeffectofmicroRNA-29bonhepaticstellatecellactivationanditscrosstalkwithTGF-β/Smad3.CellBiochemFunct,2016,34:326-333.

10ShekFW,BenyonRC.Howcantransforminggrowthfactorbetabetargetedusefullytocombatliverfibrosis?EurJGastroenterolHepatol,2004，16:123-126.

11DropmanA,DediuliaT,Bretikopf-HeinleinK,etal.TGF-β1andTGF-β2abundanceinliverdiseaseofmileandmen.Oncotarget,2016,7:19499-19518.

12DiehiAM.TumornecrosisfactoranditsPotentialroleininsulinresistanceandnonalcoholiefattyliverdisease.ClinLiverDis，2004,8:619-638.

13ChengK,YangNN,MahatoRI.TGF-β1GeneSilencingforTreatingLiverFibrosis.MolPharm,2009,6:772-779.

Effects of silencing KLF4 expression on biological behaviors of HSC-LX2 in vitro

LITao*,NIULijuan,LIUWenxuan*,etal.

*DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,PublicHealthCollege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

Objective To screen the siRNA which can effectively silence KLF4 expressions, and to observe the effects of KLF4 gene silence on biological behaviors of LX2 in human hepatic stellate cells (HSC-LX2).Methods The three pairs of siRNAs (siRNA1,siRNA2,siRNA3)targeting at human KLF4 mRNA were designed and chemically synthesized, then which were transfected into HSC-LX2. The expression levels of KLF4 mRNA and protein were detected by Real-time fluorescent quantitative PCR (Real-time RT-PCR) and Western Blot,respectively,with the nonspecific siRNA transfected into HSC-LX2 being regarded as negative control group. One of the siRNAs with the best effects of silencing KLF4 expression was selected,then which was transfected into HSC-LX2, the effects of KLF4 silence on cell proliferation of HSCs were measured by MTT.Moreover the expression levels of transforming growth factor (TGF-1),interleukin-1 (IL-1),tumor necrosis factor-α (TNF-α) in supernatant of cell culture were detected by ELISA.Results The examination results by Real-time RT-PCR and Western Blot showed that the silencing effect of siRNA3 was the best,thus,which was used in the subsequent experiments.MTT assay suggested that the cell vitalities were significantly decreased at 12h, 24h,48h after siRNA3 transfection, as compared with those in negative control group. ELISA assay showed the expression levels of TGF-1, TNF-α,IL-1 were obviously decreased at 48h after transfection, as compared with those in negative control group.Conclusion The siRNA3 can effectively silence KLF4 expression,and KLF4 gene silence can inhibit the cell proliferation of HSC-LX2 and can affect its biological behaviors to decrease the expression levels of TGF-1, TNF-α and IL-1.

human hepatic stellate cells; KLF4; TGF-β1；TNF-α；interleukin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.005

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20150627)

050017 石家莊市，河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室(李濤、劉文宣、楊磊、李曼、曹丹丹)；河北省石家莊市第三醫院腫瘤科(牛麗娟)，老年病科(彭亂順)

彭亂順，050011 河北省石家莊市第三醫院老年病科；

E-mail：litao771018@163.com

R 329.447

A

1002-7386(2017)07-0981-04

2016-01-19)