一株從青海酸奶中分離出來的嗜酸乳桿菌的分離鑒定與特性研究

張雅茹，薛 莉，左志剛，張 進，馬征途

（內蒙古雙奇藥業股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010010）

一株從青海酸奶中分離出來的嗜酸乳桿菌的分離鑒定與特性研究

張雅茹，薛 莉，左志剛，張 進，*馬征途

（內蒙古雙奇藥業股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010010）

從青海酸奶中分離鑒定出嗜酸乳桿菌，并對其進行降血脂的研究。結合細菌形態學和16S rDNA序列同源性分析進行鑒定，并通過檢測總膽固醇和甘油三酯的含量來確定嗜酸乳桿菌降血脂的能力。結果表明，從青海酸奶中分離出的菌株為嗜酸乳桿菌，其能降低小鼠血清中的膽固醇，可見嗜酸乳桿菌具有降血脂的功能。

嗜酸乳桿菌；分離鑒定；降血脂

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 屬于乳桿菌屬，是人體腸道內的重要微生物，與人體健康息息相關，當其達到一定數量時，對維護腸道健康和菌群平衡起著十分重要的作用，是目前乳酸菌家族中重點研究與開發的益生菌之一，被視為第3代酸乳發酵劑菌種[1-2]。嗜酸乳桿菌在腸道內發酵后，可產生乳酸和醋酸，能提高鈣、磷、鐵的利用率，促進鐵和VD的吸收，產生VK及VB，還可以減少膽固醇的吸收，并能降低輻射對人體的傷害，已被廣泛用于發酵食品與微生態制劑[3]。

隨著國內外眾多學者對嗜酸乳桿菌的生物學特性、功能性及應用等方面研究的不斷深入，人們越來越認識到嗜酸乳桿菌的益生特性，含有嗜酸乳桿菌的產品也日益豐富，包括酸奶、膠囊、片劑、粉劑及口服液等[4]。試驗通過對青海酸奶分離的嗜酸乳桿菌進行分離鑒定，并對其降血脂的特性進行了研究，為開發降血脂產品奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

青海酸奶。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基、MRS固體培養基。

1.1.3 主要試劑

PCR引物，上海桑尼生物科技有限公司提供；10×PCR buffer、dNTP、rTaq酶，大連寶生物有限公司提供；PCR試劑盒、膠回收試劑盒等，Invitrogen公司提供；高脂飼料包括78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽。

先熬豬油，再將膽固醇溶解，最后加膽鹽，但要掌握火候，膽鹽高溫易變硬。混勻后直接倒入飼料中，拌勻后進行烹炒，使油脂浸透。

1.1.4 試驗動物

健康清潔級昆明小鼠，由內蒙古大學動物中心提供。

1.1.5 血脂指標檢測

貝克曼庫爾特AU5800型全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

將青海酸奶用生理鹽水做系列稀釋，涂布于MRS固體培養基，于37℃條件下厭氧培養36 h，挑取單菌落，反復劃線分離至獲得純菌株。對菌落形態進行觀察，并進行革蘭氏染色。

1.2.2 糖發酵結果

試驗項目包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖酸鹽、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、白砂糖、海藻糖和木糖發酵試驗，發酵結果與《伯杰細菌鑒定手冊》進行比對[5]。

1.2.3 16S rDNA序列分析與分子鑒定

將純化好的菌株接種于10 mL無菌MRS液體培養基中，于37℃條件下培養24 h，連續培養3代后采用CTAB法提取其總DNA[6]，并利用細菌通用引物PCR擴增其16S rDNA片段[7]。上游引物序列為：5'-CAGA GTTT GATC CTGG CT-3'；下游引物序列為5'-AGGA GGTG ATCC AGCC GCA-3'。PCR反應體系（25 μL），其中包括：上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板DNA0.5 μL，5×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP.1 μL，加超純水至25 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR擴增程序：98℃，3 min；98℃，25 s；55℃，25 s；72℃，1 min；30個循環，72℃，10 min；4℃保溫。將PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度約1 500 bp后的陽性產物直接送至上海桑尼生物技術有限公司進行序列測定，得到的序列運用軟件校準排齊后，在GenBank數據庫中進行Blast同源性比對分析，將待測菌株鑒定到種。

1.2.4 小鼠血清血脂的變化

將昆明雄性小鼠隨機分成4組，每組20只，分別為空白對照組、模型對照組、嗜酸乳桿菌高劑量組（1.0×109CFU/只）、嗜酸乳桿菌低劑量組（1.0× 107CFU/只）4個組。空白對照組用基礎飼料喂養，其余3組喂高脂飼料，定時定量給食及飲水，自由攝取，喂養15 d，待高脂模型建立后，每組隨機取10只小鼠，測體重后對眼球采血，采血后盡快分離血清，測定總膽固醇和甘油三酯。模型建立后，空白對照組繼續給予基礎飼料，模型對照組及試驗組繼續給予高脂飼料。空白對照組每天灌胃生理鹽水2 mL/只；模型對照組每天灌胃生理鹽水2 mL/只；試驗組每天分別灌胃嗜酸乳桿菌1.0×109CFU/只和1.0×107CFU/只，并定期稱量體重，待15 d給藥結束后，對每組剩余10只小鼠進行眼球取血，測定總膽固醇和甘油三酯。

2 結果

2.1 菌體鏡檢結果

顯微鏡下嗜酸乳桿菌的形態見圖1。

圖1 顯微鏡下嗜酸乳桿菌的形態

由圖1可知，革蘭氏染色為陽性，兩端鈍圓、中等大小、無芽胞、不運動的桿菌，以單個、成雙或短鏈狀出現。

2.2 糖發酵結果

嗜酸乳桿菌糖發酵鑒定結果見表1。

表1 嗜酸乳桿菌糖發酵鑒定結果

由表1可知，該細菌發酵苦杏仁苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露糖、核糖、水楊苷和蔗糖，不發酵阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、葡萄糖酸鹽、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、山梨醇和木糖，符合《伯杰細菌鑒定手冊》對嗜酸乳桿菌特點的描述，初步鑒定為嗜酸乳桿菌。

2.3 核酸鑒定結果

16S rDNA基因目的片段和PCR產物見圖2。

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，由圖2可以觀察到在1 500 bp左右處有一明亮的特征條帶，表面擴增16S rDNA成功。

嗜酸乳桿菌16S rDNA測序見圖3。

經過與GenBank中已發表菌株的標準序列進行同源性比較，此菌株與嗜酸乳桿菌的同源性為99.3%。

2.4 嗜酸乳桿菌對高脂小鼠的影響

2.4.1 嗜酸乳桿菌對高脂小鼠體重的影響

圖2 16S rDNA基因目的片段和PCR產物

圖3 嗜酸乳桿菌16S rDNA測序

嗜酸乳桿菌對小鼠體重的影響見圖4。

圖4 嗜酸乳桿菌對小鼠體重的影響

由圖4可知，試驗初期各高脂組小鼠的初始體重與空白組有顯著差異，但3個高脂組間無差異。試驗末各組小鼠的體重均有增加，其中模型對照組的體重增加最多為13.5 g，樣品低劑量組和高劑量組的體重增加分別為10.1 g和9.2 g，空白對照組增加8.2 g。通過體重可以看出，高脂飼料會導致小鼠體重顯著增加，樣品組間無顯著差異，但與模型對照組間有差異，說明嗜酸乳桿菌可以控制高血脂小鼠的體重。

2.4.2 嗜酸乳桿菌對高脂小鼠總膽固醇的影響

大豆卵磷脂對高脂小鼠血清膽固醇含量的影響見圖5。

由圖5可知，試驗前模型對照組與樣品組無顯著差異，但3組的總膽固醇含量均高于空白對照組。試驗末模型組的總膽固醇最高為2.96 mmol/L，高劑量組和低劑量組的總膽固醇分別為2.70 mmol/L和2.58mmol/L，空白對照組的總膽固醇為2.57 mmol/L。說明嗜酸乳桿菌可以降低血液中總膽固醇的含量，且呈現一定數量關系。

2.4.3 嗜酸乳桿菌對高脂小鼠甘油三酯的影響

大豆卵磷脂對血清甘油三酯含量的影響見圖6。

圖5 大豆卵磷脂對高脂小鼠血清膽固醇含量的影響

圖6 大豆卵磷脂對血清甘油三酯含量的影響

由圖6可知，試驗前模型組與樣品組無顯著差異，但3組的甘油三酯含量均高于空白對照組。試驗末模型對照組的甘油三酯含量最高為1.87 mmol/L，高劑量組和低劑量組的甘油三酯含量分別為1.39 mmol/L和1.26 mmol/L，空白對照組的甘油三酯為1.06 mmol/L。說明嗜酸乳桿菌可以降低血液中甘油三酯的含量。

3 討論

（1）從青海酸奶中分離出來的菌經過16S rDNA鑒定為嗜酸乳桿菌。

（2）嗜酸乳桿菌能降低高血脂昆明小鼠血液中總膽固醇和甘油三酯的含量。

2014年8月8日，《中國心血管病報告2013》顯示，心血管病死亡占城鄉居民總死亡原因的首位，而這些心血管疾病絕大多數是由高血脂導致的動脈硬化而引起。在血脂異常人群中，據2010年全國調查發現，血清總膽固醇≥6.22 mmol/L的患病率分別占18歲以上男性、女性的3.4%和3.2%，血清甘油三酯≥2.26 mmol/L的男女患病率分別為13.8%和8.6%。中國心血管病危險因素流行趨勢明顯，導致心血管病的發病人數持續增加，而今后10年心血管病患病人數仍將快速增長。目前，市面上治療腦血管疾病的藥物大多有副作用，如硝酸酯是治療腦血管疾病的一種常用藥物，但是長期服用就會導致身體內部的調節機制紊亂，使血管收縮，藥物的療效降低。因此，開發一種對人體無副作用的降脂保健品必將有廣闊的市場。

[1]FullerR.Peobioticsinhumanmedicine[J].Gut，1991（32）：439-442.

[2]趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應用研究 [M].北京：科學出版社，2007：22-29.

[3]奚灝鏘，袁根良，杜冰，等.嗜酸乳桿菌發酵培養工藝研究 [J].廣東飼料，2009，18（8）：20-22.

[4]范興藝.嗜酸乳桿菌的分離、鑒定及其在發酵豆乳中生長特性的研究 [D].杭州：浙江工商大學，2008.

[5]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊 [M].北京：科學出版社，1984：802．

[6]F·奧斯伯，R·布倫特．精編分子生物學實驗指南 [M]．顏子穎，王海林，譯．北京：科學出版社，1998：37-39．

[7]Mauro S，Diego M，Silvia C，et al．Development of genus species specific PCR analysis for identification of carno bacterium strains[J]．Curr Microbiol，2002，45（1）：24-29.◇

Isolation and Identification and Characteristic Study of one Lactobacillus Acidophilus in Yogurt from Qinghai

ZHANG Yaru，XUE Li，ZUO Zhigang，ZHANG Jin，*MA Zhengtu
（Inner Mongolia Shuangqi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China）

To isolate one kind of Lactobacillus acidophilus in yogurt from Qinghai and investigate its hypolipidemic action. Bacterial identification is performed on the basis of bacterial morphology and 16S rDNA sequence homology analysis，and the hypolipidemic action is researched by determining Lactobacillus acidophilus reducing the content of total cholesterol and triglycerides.The results show that the bacterium is Lactobacillus acidophilus，which can reduce content of total cholesterol and triglycerides.Lactobacillus acidophilus is characterized by reducing blood fat.

Lactobacillus acidophilus；isolationd and identification；hypolipidemic action

Q93.34

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.050

1671-9646（2017）01b-0044-03

2016-11-14

張雅茹（1976— ），女，本科，中級化工制藥，研究方向為微生態制劑。

*通訊作者：馬征途（1980— ），男，在讀碩士，中級化工制藥，研究方向為微生態制劑。