產氣腸桿菌攜帶基因blaNDM-1的質粒特征及基因環境分析

肖偉強，許青霞，李鐵鵬，王智中，潘 軍，姚新偉，常彥敏，孫明月

(鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南 鄭州 450000)

·論著·

產氣腸桿菌攜帶基因blaNDM-1的質粒特征及基因環境分析

肖偉強，許青霞，李鐵鵬，王智中，潘 軍，姚新偉，常彥敏，孫明月

(鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南 鄭州 450000)

目的 了解產氣腸桿菌攜帶blaNDM-1質粒的轉移性、復制子分型及周圍環境。方法 產氣腸桿菌HN-NDM0711為實驗菌株，利用接合實驗研究其質粒的轉移性，對接合子進行穩定性試驗，采用質粒復制子分型法對質粒進行分型，利用染色體步移技術對基因blaNDM-1上下游進行測序，使用BLASTN和BLASTP對基因組序列進行比對，使用Vector NTI 11.5.1注釋并生成序列管道圖，序列通過軟件Banklt遞交至Genbank。結果 產氣腸桿菌HN-NDM0711接合實驗陽性，陽性接合子穩定傳代4 d后，所有克隆株對亞胺培南和美羅培南的最低抑菌濃度(MIC)均未發生變化，基因blaNDM-1均為陽性。質粒復制子為IncA/C型；基因blaNDM-1位于不常見的插入序列ISAba14和IS91之間，在blaNDM-1的上游出現一個Tn3轉座子和I型整合子，整合子上含有一個由龐大鑲嵌序列構成的少見耐藥基因盒。 結論 IncA/C型質粒pHN-NDM0711攜帶基因blaNDM-1及耐藥基因盒，可能源于不同抗菌藥物選擇壓力下的基因重組，建議嚴格控制臨床、工業和農業抗菌藥物的使用，從源頭上減少此類細菌的產生。

產氣腸桿菌； NDM-1； 接合實驗； 質粒復制子分型； β-內酰胺酶

[Chin J Infect Control，2017，16(3)：195-198]

耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的出現和傳播成為全球公共健康的重大威脅，其中獲得性金屬類β-內酰胺酶，如新德里金屬β-內酰胺酶基因(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)也可造成碳青霉烯類抗生素耐藥[1-2]。研究[2-3]表明，基因NDM-1多發現于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等細菌中，常存在于IncA/C、IncF、IncFII等不同類型的質粒上，該基因周圍存在不同的基因環境。在前期的實驗中，本課題組發現了3株因交叉感染而引起傳播的產氣腸桿菌[4]，均表現為多重耐藥，金屬酶表型實驗和聚合酶鏈反應(PCR)方法均證實攜帶基因NDM-1，脈沖場凝膠電泳實驗證實為同一型別，但尚不清楚其攜帶blaNDM-1質粒的轉移性、復制子分型及基因環境等特征，且較少文獻報道產氣腸桿菌攜帶blaNDM-1的基因周圍環境，故對此進行研究，現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 菌株及來源 本院有3株具有同源性的產氣腸桿菌(均攜帶NDM-1基因)引起的交叉感染，取其中1株產氣腸桿菌0711(HN-NDM0711)，該菌株僅對多粘菌素、左氧氟沙星和環丙沙星敏感，對碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、單環β-內酰胺類等抗菌藥物全部耐藥，菌株及患者信息見文獻[4]。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，耐疊氮鈉大腸埃希菌J53由河南農業大學杜向黨教授提供。

1.2 儀器與試劑 全自動細菌鑒定儀Phenix-100為美國BD公司產品，PCR擴增儀購自美國ABI公司，凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司產品。質粒DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，疊氮鈉和美羅培南均購自Sigma公司，DNA Marker和2×PCR Premix購自大連寶生物公司，引物合成及測序由上海生工技術有限公司完成。

1.3 接合試驗 產氣腸桿菌HN-NDM0711為供體菌，大腸埃希菌J53為受體菌，取兩種細菌對數生長期菌液各1 mL，加入100 mL的營養肉湯中，37℃靜置過夜，取200 μL均勻涂布于篩選平板上(含100 μg/mL疊氮鈉和2 μg/mL美羅培南)，培養12～24 h，并用瓊脂稀釋法測定接合子的亞胺培南和美羅培南最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。試劑盒提取接合子質粒DNA，命名為pHN-NDM0711，PCR方法檢測blaNDM-1基因[4]。

1.4 接合子穩定性試驗[5]挑取陽性接合子接種于不含抗菌藥物的LB肉湯培養基中，37 ℃ 300 r/min震蕩過夜，使用LB肉湯培養基稀釋至103CFU/mL，繼續震蕩過夜，用同樣方法連續稀釋震蕩培養4 d，分別在第2、3和4 天取0.1 mL的培養液，用0.9 mL的生理鹽水稀釋，傾注于營養瓊脂平板，37 ℃培養過夜，挑10個菌落(共30個菌落)測定亞胺培南和美羅培南的MIC，并提取質粒DNA檢測blaNDM-1基因。

1.5 質粒復制子分型(PCR-based replicon typing，PBRT分型) 提取的質粒DNA作為模板，利用18對引物，使用5次多重PCR和3次單一PCR擴增FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA等質粒復制子類型，PCR反應條件和結果判讀均參照相關文獻[6]。

1.6blaNDM-1基因周圍序列測序 提取的質粒DNA送交上海生工項目部，采用DNA步移技術對目的基因blaNDM-1周圍序列測序，blaNDM-1基因號：KJ577744[4]。

1.7 DNA序列注釋和遞交 使用GeneMark軟件進行基因預測，并通過軟件BLASTN 和軟件BLASTP雙向比對基因的相似性，使用Vector NTI 11.5.1注釋并生成序列管道圖，序列通過軟件Banklt遞交到Genbank獲得序列號為KU764665。

2 結果

2.1 接合實驗和blaNDM-1基因擴增結果 篩選平板培養12 h有細小菌落，24 h有明顯單個菌落，鑒定為大腸埃希菌，測定亞胺培南和美羅培南的MIC分別為4、8 μg/mL，blaNDM-1基因檢測陽性。

2.2 接合子穩定性試驗結果 陽性接合子穩定傳代4 d后，所有克隆株對亞胺培南和美羅培南的MIC均未發生變化，blaNDM-1均為陽性。

2.3 PBRT分型結果 使用A/C的正反向引物擴增，在400 bp附近(目的基因為465 bp)處有清晰條帶，證明供體菌和陽性接合子的質粒均為IncA/C型。見圖1。

M：DL1000 DNA Marker，1：陽性接合子，2：產氣腸桿菌0711

圖1 陽性接合子和產氣腸桿菌0711質粒的PBRT分型電泳圖

Figure 1 PBRT map of positive conjugant andE.aerogenes0711 plasmid

2.4 基因環境分析 測序獲得一段18 621 bp的DNA序列，共包含17個核心編碼序列(coding sequences，CDS)。blaNDM-1位于IS91和ISAba14之間,下游為ISAba125，上游為bleo、trpF和dsbC；緊接此序列是I型整合子，除攜帶實現其自身功能的整合酶基因(int I1)外，還攜帶由一個由dfrA14、arr-2、cmlA7、blaOXA-10、aadA1、qacEdelta1、sul I構成的龐大耐藥基因盒。在I型整合子的上游，含有一個Tn3的轉座子，同時攜帶有實現其自身功能的轉座酶和解旋酶。比對發現序列上游(1～13 099 bp)與來自于肺炎克雷伯NDM-1基因陰性的pHM881QN(LC055503)和IncA/C-LS6(JX442976)具有高度相似性(>99%)，而下游攜帶blaNDM-1(13 100～18 621 bp)序列與來自鮑曼不動桿菌GB661的質粒(KP009590)具有高度的相似性(>99%)，但方向相反。見圖2。

注：箭頭代表轉錄方向，灰色表示一致性序列。基因名稱、編碼蛋白分別為Tn3 tnpA(Tn3轉座酶)、Tn3 tnpR(Tn3 解旋酶)、IntI1(Int I型整合酶)、dfrA14(二氫葉酸還原酶，磺胺類增效劑耐藥)、arr-2(利福平ADP-核糖基化轉移酶)、cmlA7(氯霉素耐藥蛋白)、blaOXA-10(β-內酰胺酶)、aadA1(氨基糖苷乙酰轉移酶)、qacEdelta1(季銨鹽類外排泵)、sulI(二氫蝶酸合成酶，磺胺類耐藥)、IS91(插入序列元件)、dsbC(二硫鍵異構酶)、trpF[ N -(5’-磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構酶]、bleo(博來霉素耐藥蛋白)、NDM-1(金屬β-內酰胺酶)、aphA6(氨基糖苷類3'磷酸轉移酶)、Isba14(插入序列元件)

圖2blaNDM-1的基因環境示意圖

Figure 2 Diagram of genetic environment ofblaNDM-1

3 討論

本文接合實驗及PBRT分型表明，產氣腸桿菌攜帶blaNDM-1基因的質粒為可轉移性IncA/C質粒。blaNDM-1位于IS91和ISAba14之間，為一段保守的序列[7-8]，IncA/C型質粒是攜帶blaNDM-1的重要載體[2-3, 8]，該質粒能介導多重耐藥，其宿主廣泛，普遍存在于人和家禽的腸道菌群中，IncA/C型質粒也是攜帶超廣譜β-內酰胺酶和Ampc酶等碳青霉烯酶的重要載體。近幾年引起人們的關注，IncA/C型質粒上常存在可轉移性的基因元件，如轉座子、I型整合子和ISCRs類插入序列，使其攜帶耐藥基因易發生轉移[8-9]。

接合子穩定性試驗表明，陽性接合子的多重耐藥特征可穩定傳代，符合IncA/C質粒的特征，與文獻[2, 7-8]報道一致。文獻[10]報道，來自鮑曼不動桿菌產NDM-1的質粒導入大腸埃希菌J53后，接合子質粒不穩定，容易丟失，因此，轉移性IncA/C型質粒引起的潛在傳播方式應引起更多的關注。

基因測序獲得了一段18 621 bp的序列，比對發現序列上游(1～13 099 bp)與來自于肺炎克雷伯NDM-1基因陰性的pHM881QN(LC055503)和IncA/C-LS6(JX442976)具有高度相似性(>99%)，而下游攜帶blaNDM-1(13 100～18 621 bp)序列與來自鮑曼不動桿菌GB661的質粒(KP009590)具有高度的相似性(>99%)，但方向相反；進一步分析發現除blaNDM-1上下游保守序列外，還存在ISAba14及IS91，與通常插入序列(如ISCR1[11]或IS26[12])不同，推測類似pHM881QN的質粒通過ISAba14及IS91作用發生了DNA反向重組[13]。

blaNDM-1基因的上游序列(1～13 099 bp )含有Tn3轉座子、I型整合子及其攜帶的“鑲嵌拼接區(mosaic plasmid structure)”，此區域除了含有實現其自身功能的轉座酶、解旋酶和整合酶外，還含有一個高達7個耐藥基因的龐大基因盒(dfrA14-arr-2-cmlA7-blaOXA-10-aadA1-qacEdelta1-sulI)，分別介導對磺胺類、氨基糖苷類、利福平、季銨鹽類、窄譜頭孢菌素等耐藥。通常blaNDM-1的上游類似區域整合子攜帶的基因盒多為2～5個[8, 11-12]，而本組結果高達7個，說明此區域的高度可變性，可能此區域內發生多次DNA重組。攜帶耐藥基因的細菌所耐抗菌藥物中，部分藥物雖與臨床有關，但更多的藥物與家禽養殖和環境消毒有關，如季銨鹽類并不是臨床使用的抗菌藥物，僅用于食品工業和環境消毒，因其選擇性壓力，造成在零售的肉類等食品中檢出率很高[14]；氯霉素、氨基糖苷類、利福平也是獸藥的常見成分，推測本研究發現的由I型整合酶攜帶的超級耐藥基因盒可能與食品工業和環境消毒濫用抗菌藥物/消毒劑有關。

總之，產氣腸桿菌HN-NDM0711多重耐藥的原因是IncA/C型可轉移性質粒攜帶的blaNDM-1及一個龐大的耐藥基因盒，此質粒可能來源于臨床、農業和環境所使用的不同抗菌藥物/消毒劑壓力下的基因重組，因此，減少細菌耐藥不僅要加強臨床合理使用抗菌藥物的管理，也應加強對工農業使用抗菌藥物的控制，從源頭上減少此類“超級細菌”的產生。

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(本文編輯：豆清婭)

Characteristics andblaNDM-1genetic environment of plasmid fromEnterobacteraerogenes

XIAOWei-qiang,XUQing-xia,LITie-peng,WANGZhi-zhong,PANJun,YAOXin-wei,CHANGYan-min,SUNMing-yue

(AffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

Objective To study plasmid-mediated transfer, plasmid replicon typing, and genetic environment ofblaNDM-1gene inEnterobacteraerogenes(E.aerogenes).MethodsE.aerogenesHN-NDM0711 was used as the subject of this research, the transferable properties of plasmid were analyzed by conjugation testing, conjugant was performed stability testing, plasmid type was determined by PCR-based replicon typing (PBRT), downstream and upstream ofblaNDM-1were sequenced using chromosome walking method, genetic context was analyzed by BLASTN and BALSTP, as well as annotated using Vector NTI 11.5.1 software, sequence pipeline graph was made, the sequence was submitted to Genbank through software Banklt.Results The conjugation testing ofE.aerogenespHN-NDM0711 was positive, after positive conjugant was conducted 4-day passage, minimal inhibitory concentrations (MICs) of imipenem and meropenem to all the cloned strains didn’t change,blaNDM-1were all positive. The replicon type was IncA/C;blaNDM-1gene was localized between ISAba14 and IS91, at upstream of theblaNDM-1, class 1 integron and Tn3 transposon were identified, class 1 integron contained a new mosaic structure of a drug-resistant resistance gene cassette.ConclusionE.aerogenespHN-NDM0711, bearingblaNDM-1gene in IncA/C plasmid, derived from gene recombination under different antimicrobial selection pressure. Antimicrobial use in clinical, industrial and agricultural area should be strictly controlled, so as to reduce the emergence of such bacteria.

Enterobacteraerogenes； NDM-1； conjugation testing; plasmid replicon typing; β- lactamase

2016-05-05

河南省衛生廳科技攻關項目(201503192)

肖偉強(1975-)，男(漢族)，河南省鄭州市人，主管技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

許青霞 E-mail：xiaowq126@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.03.001

R378.2

A

1671-9638(2017)03-0195-04