HBV DNA整合與乙型肝炎、PHC關(guān)系的研究進(jìn)展

吳殿磊,徐光華,劉娜(1西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西咸陽(yáng)7108；延安大學(xué)附屬醫(yī)院)

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HBV DNA整合與乙型肝炎、PHC關(guān)系的研究進(jìn)展

吳殿磊1,2,徐光華2,劉娜2
(1西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西咸陽(yáng)712082；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院)

乙型肝炎病毒(HBV)是導(dǎo)致慢性肝炎的主要病因,同時(shí)亦是原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PHC)的主要危險(xiǎn)因素之一，研究證實(shí)HBV可通過(guò)整合自身基因進(jìn)入到宿主基因組中或通過(guò)其結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過(guò)表觀遺傳導(dǎo)致宿主基因突變,突變主要包括肝細(xì)胞部分DNA缺失和染色體重排等。HBV DNA整合對(duì)病毒本身和宿主肝細(xì)胞可產(chǎn)生影響，系列研究表明,乙型肝炎慢性化和PHC的發(fā)生發(fā)展與HBV DNA選擇性整合可能存在關(guān)聯(lián),與乙型肝炎慢性化和PHC相關(guān)聯(lián)整合位點(diǎn)的鑒定,將為乙型肝炎慢性化機(jī)制研究提供新的思路和線索,對(duì)未來(lái)臨床基因診斷和治療CHB及PHC有指導(dǎo)意義。

乙型肝炎；原發(fā)性肝細(xì)胞癌；乙型肝炎病毒DNA;整合位點(diǎn)鑒定

HBV是迄今發(fā)現(xiàn)最小的不完全環(huán)狀嗜肝DNA病毒，HBV感染可致急慢性乙肝，亦是誘發(fā)原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PHC)的重要危險(xiǎn)因素之一。HBV DNA可通過(guò)整合進(jìn)入到宿主基因組中或通過(guò)其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過(guò)表觀遺傳導(dǎo)致宿主基因突變和染色體重排[1],突變主要包括病毒基因、宿主基因和染色體的變化，HBV DNA整合對(duì)病毒本身和宿主肝細(xì)胞可產(chǎn)生影響，部分突變與乙肝慢性化和終末期肝病(肝硬化、PHC)有關(guān)。現(xiàn)就HBV DNA整合與慢性乙肝、隱匿性HBV感染(OHBI)、PHC的關(guān)系綜述如下，以期為乙肝慢性化機(jī)制研究及PHC基因診斷和治療提供新的思路和線索。

1 HBV DNA整合概述

雖然HBV是DNA病毒，但因其在復(fù)制過(guò)程中存在獨(dú)特的前基因組反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，所以其基因組有機(jī)會(huì)整合至人基因組中。與逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染不同,HBV DNA整合不是病毒復(fù)制所必須,所以HBV基因整合在其自然史中并非常規(guī)事件[2,3]。1980年首次在乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌中檢測(cè)到HBV DNA整合[4]，以后相繼在急、慢性乙肝、肝癌組織中檢測(cè)到多種不同形式的HBV DNA整合[3,5～8]。HBV基因整合至宿主基因組中有利于其持久感染,長(zhǎng)期的慢性炎癥可致肝細(xì)胞生命周期改變和增殖,這就增加了宿主基因組DNA終端的數(shù)量,從而有利于HBV DNA整合到宿主基因組中,這一過(guò)程拓?fù)洚悩?gòu)酶I是關(guān)鍵性因子[9，10]。宿主基因組最常見(jiàn)的改變是倒立重復(fù)和缺失[4]。研究表明,HBV基因整合方式分為起始于順向重復(fù)序列(DR)1，DR1向負(fù)鏈3'端延伸；起始于DR1向負(fù)鏈5'端延伸；起始于DR2向負(fù)鏈3'端延伸；起始于DR2向負(fù)鏈5'端延伸[2,11]。

慢性炎癥或病毒重疊感染可使肝細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激或誘變環(huán)境,喪失DNA修復(fù)能力,這可能是HBV DNA能整合至宿主基因組的重要原因[9]。HBV整合可誘導(dǎo)宿主基因組相應(yīng)位置重排或部分缺失[12]。近期研究表明HBV DNA整合并非完全隨機(jī),存在優(yōu)先選擇性。基因轉(zhuǎn)位、融合、缺失和廣泛的基因組不穩(wěn)定性可能是HBV DNA整合的原因,整合后宿主基因組的改變有機(jī)會(huì)產(chǎn)生選擇性肝細(xì)胞克隆,HBV從而獲益[4]。HBV基因整合一方面有利于其生存,另一方面可致宿主基因組某些位點(diǎn)突變,部分突變與乙肝慢性化有關(guān),亦與PHC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2 HBV DNA整合與肝細(xì)胞癌變的關(guān)系

HBV感染是PHC的重要危險(xiǎn)因素之一，文獻(xiàn)報(bào)道，80%以上的肝癌組織中可檢測(cè)到HBV DNA整合[13,14]。肝癌發(fā)生可能是HBV整合的結(jié)果[15],HBV整合可致肝細(xì)胞凋亡和抗癌基因信號(hào)通路異常[4]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR、Alu PCR和限制性核酸酶切位點(diǎn)PCR技術(shù),HBV感染者甚至急性自限性乙肝患者HBV DNA能插入到機(jī)體基因組中。在85%～90%與HBV感染相關(guān)性PHC患者中能檢測(cè)到整合的HBV DNA[9]。

據(jù)報(bào)道大部分整合發(fā)生在常見(jiàn)的基因脆弱部位附近或其中,如易于被刪除、斷裂、重排和擴(kuò)增的基因[4],控制基因增殖、細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)的序列變異或不穩(wěn)定Alu序列和微衛(wèi)星序列變化可致癌基因的發(fā)生發(fā)展。整合到基因組中編碼區(qū)或基因調(diào)節(jié)區(qū)的HBV DNA可改變宿主基因的表達(dá)或改變?cè)摶蛩磉_(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,這有可能導(dǎo)致惡變[9]。整合的HBV DNA表達(dá)合成成熟的preS/S和X蛋白觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亦可使肝細(xì)胞發(fā)生惡變[9]。HBV基因組的增強(qiáng)子原件能按照一定方向或與位置無(wú)關(guān)的方式激活異源性啟動(dòng)子,HBV基因增強(qiáng)子能反式激活距離整合處100 kb的宿主細(xì)胞基因[4]。

PHC患者HBV DNA整合靶基因區(qū)在早期研究中未明確，最近10年才有部分研究關(guān)注在PHC中HBV DNA整合位點(diǎn)和插入性突變。Paterlini-Bréchot等[5]采用HBV-Alu PCR技術(shù)從肝細(xì)胞癌患者標(biāo)本中分離出9個(gè)HBV DNA整合區(qū),這表明病毒導(dǎo)致的突變與PHC有關(guān)。位于HBV DNA整合區(qū)不同的基因具有特定關(guān)鍵性功能,這些功能與細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)或許有關(guān)。另外他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合的靶基因：hTERT和IP3R基因在2例患者腫瘤組織中均出現(xiàn),尤其人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因[5]。Kimbi等[16]擴(kuò)增5例急性乙肝患者和1例爆發(fā)性肝炎患者血HBV DNA和宿主基因組相應(yīng)染色體DNA。在1例急性乙肝患者中,HBV DNA整合到宿主染色體7q11.23的位置,這是威廉姆斯-博伊倫綜合征關(guān)鍵區(qū)域1基因所在位置,這個(gè)基因包含大量Alu重復(fù)序列、重復(fù)原件,這些位點(diǎn)是HBV DNA容易插入和重組的位點(diǎn)，且整合子在威廉姆斯-博伊倫綜合征患者通常被刪除基因序列的區(qū)域內(nèi),引起雜合性缺失。該研究組亦提到整合子克隆擴(kuò)增與腫瘤形成有關(guān),而早期HBV DNA整合可能誘發(fā)肝癌發(fā)生。

3 HBV DNA整合與慢性乙肝的關(guān)系

Murakami 等[6]以Alu-PCR法分別檢測(cè)了19例急性乙肝患者、12例HBV相關(guān)慢性活動(dòng)性肝炎患者、19例急性乙肝患者中3例肝臟標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合、全部12例HBV相關(guān)慢性活動(dòng)性肝炎患者肝臟標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)存在病毒整合，表明慢性乙肝HBV DNA整合率顯著高于急性乙肝，推測(cè)乙肝慢性化與HBV DNA整合有關(guān)。Shi等[17]報(bào)道HBV DNA特定位點(diǎn)整合可致T細(xì)胞缺陷，而乙肝慢性化與T細(xì)胞缺陷有關(guān)。

Minami等[18]研究慢性HBV感染HBV DNA在肝細(xì)胞的整合,在6例患者肝臟組織中他們檢測(cè)到42個(gè)獨(dú)立的HBV DNA和肝細(xì)胞基因的結(jié)合部位,其中20個(gè)完成染色體定位。表明HBV DNA與宿主基因的每個(gè)整合,受到宿主6個(gè)基因克隆體中1個(gè)的影響。在這6個(gè)基因中,AXIN 1 (Axis)是抑制肝癌的基因;EYA3 、bobby sox和odd Oz 2基因?qū)τ谄鞴俚纳L(zhǎng)發(fā)育有重要作用,但他們的功能尚未明確。該研究提示HBV DNA優(yōu)先整合到3號(hào)染色體。混合系白血病(MLL)2和4基因亦被認(rèn)為是HBV DNA優(yōu)先整合的靶基因[19,20]。MLL4基因位于19號(hào)染色體19q13.1,該處基因在實(shí)體瘤中研究顯示存在擴(kuò)增和重排。整合后特定位點(diǎn)表達(dá)的HBV X (HBx)或MLL4轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物和蛋白與肝癌的發(fā)生有關(guān)[20]。乙肝慢性化與HBV DNA整合及優(yōu)先的選擇性整合可能存在關(guān)聯(lián)。

早期，人們主要應(yīng)用印記雜交、克隆測(cè)序和各種PCR的方法[20]來(lái)確定HBV整合。如今已開(kāi)發(fā)應(yīng)用新一代高通量測(cè)序(NGS)技術(shù)來(lái)鑒定HBV DNA特定的整合位點(diǎn)[21]。NGS亦稱深度測(cè)序,與第一代Sanger測(cè)序法相比，NGS 技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)。NGS技術(shù)已大規(guī)模用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、染色體免疫共沉淀測(cè)序、基因組甲基化測(cè)序、宏基因組測(cè)序、基因組從頭測(cè)序和全基因組的重新測(cè)序等方面。目前，主要的高通量測(cè)序平臺(tái)較多，以Hiseq和Miseq應(yīng)用最為廣泛。

考慮到全基因組測(cè)序費(fèi)用過(guò)高,Ding等[22]開(kāi)發(fā)了另外一種可選的方法,用于鑒定HBV DNA整合位點(diǎn),這一價(jià)廉而有效的方法稱為MAPS法[22]。通過(guò)這種方法,除了兩個(gè)熟悉的FN1和TERT1靶基因,他們還鑒定出2個(gè)新的HBV DNA整合位點(diǎn)基因,即肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)4和SMAD5基因。他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA優(yōu)先選擇17號(hào)染色體,且更多地整合到人基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。

4 HBV DNA整合與OHBI的關(guān)系

OHBI可檢測(cè)到HBV DNA,但血清中HBsAg等檢測(cè)不到。HBV DNA整合與OHBI關(guān)系尚不清楚，Bhargava等[23]研究發(fā)現(xiàn)，OHBI可致外周血淋巴細(xì)胞損害,OHBI與氧化應(yīng)激有關(guān)。Pollicino等[24]報(bào)道了1例43歲PLC患者血清HBV和HCV檢測(cè)陰性,但HBV-Alu PCR顯示存在HBV DNA整合體,這個(gè)整合體位于PARD6G 基因上游,該基因在肝腫瘤組織中過(guò)表達(dá)。這兩項(xiàng)研究表明OHBI導(dǎo)致基因表達(dá)異常可能與癌基因致癌途徑有關(guān)。

HBV DNA有效整合到宿主基因組可增加OHBI幾率，同時(shí)亦增加了癌變機(jī)會(huì)。最常見(jiàn)的HBV整合位點(diǎn)發(fā)生在MLL和hTERT基因,另外,60S核糖體蛋白基因、血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體基因和鈣信號(hào)相關(guān)基因突變亦可能與癌變有關(guān)[3]。

綜上所述，我們可通過(guò)PCR、基因測(cè)序、基因克隆、芯片和免疫組化等方法來(lái)研究HBV DNA對(duì)宿主基因組的影響,主要包括與乙肝慢性化和PHC發(fā)生發(fā)展有關(guān)的研究。初步的研究表明乙肝慢性化與HBV DNA整合及優(yōu)先的選擇性整合可能有關(guān)，但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。由HBV DNA整合引起的宿主基因突變鑒定及如何致PHC成為最近該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。機(jī)體癌基因產(chǎn)生和激活是多因素共同作用的結(jié)果，其中HBV DNA整合到宿主基因組是直接機(jī)制之一,其他還可通過(guò)其結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過(guò)表觀遺傳致宿主基因突變,部分突變與PHC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但這些因素致癌機(jī)制及各因素之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

[1] Tarocchi M, Polvani S, Marroncini G, et al. Molecular mechanism of hepatitis B virus-induced hepatocarcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(33):11630-11640.

[2] 哈明昊,魏來(lái).乙型肝炎病毒基因的整合機(jī)制及對(duì)宿主的影響[J].世界華人消化雜志,2006,14(8):743-746.

[3] Murakami Y, Saigo K, Takashima H, et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas[J]. Gut, 2005,54(8):1162-1168.

[4] Bonilla GR, Roberts LR. The role of hepatitis B virus integrations in the pathogenesis of human hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2005,42(5):760-767.

[5] Paterlini-Brechot P, Saigo K, Murakami Y, et al. Hepatitis B virus-related insertional mutagenesis occurs frequently in human liver cancers and recurrently targets human telomerase gene[J]. Oncogene, 2003,22(25):3911-3916.

[6] Murakami Y, Minami M, Daimon Y, et al. Hepatitis B virus DNA in liver, serum, and peripheral blood mononuclear cells after the clearance of serum hepatitis B virus surface antigen[J]. J Med Virol, 2004,72:203-214.

[7] Toyoda H, Kumada T, Kaneoka Y, et al. Impact of hepatitis B virus (HBV) X gene integration in liver tissue on hepatocellular carcinoma development in serologically HBV-negative chronic hepatitis C patients[J]. J Hepatol, 2008,48(1):43-50.

[8] Feitelson MA, Lee J. Hepatitis B virus integration, fragile sites, and hepatocarcinogenesis[J]. Cancer Lett, 2007,252(2):157-170.

[9] Pollicino T, Saitta C, Raimondo G. Hepatocellular carcinoma: the point of view of the hepatitis B virus[J]. Carcinogenesis, 2011,32(8):1122-1132.

[10] Schirmacher P, Wang H, Stahnke G, et al. Sequences and structures at hepadnaviral integration: recombination sites implicate topoisomerase I in hepadnaviral DNA rearrangements and integration[J]. J Hepatol, 1995,22(1 Suppl):21-33.

[11] Shih C, Burke K, Chou MJ, et al. Tight clustering of human hepatitis B virus integration sites in hepatomas near a triple-stranded region[J]. J Virol, 1987,61(11):3491-3498.

[12] Lupberger J, Hildt E. Hepatitis B virus-induced oncogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(1):74-81.

[13] Lugassy C, Bernuau J, Thiers V, et al. Sequences of hepatitis B virus DNA in the serum and liver of patients with acute benign and fulminant hepatitis[J]. J Infect Dis, 1987,155(1):64-71.

[14] Sung WK, Zheng H, Li S, et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Genet, 2012,44(7):765-769.

[15] Amaddeo G, Cao Q, Ladeiro Y, et al. Integration of tumour and viral genomic characterizations in HBV-related hepatocellular carcinomas[J]. Gut, 2015,64(5):820-829.

[16] Kimbi GC, Kramvis A, Kew MC. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(41):6416-6421.

[17] Shi Y, Lan Y, Cao F, et al. Infected hematopoietic stem cells and with integrated HBV DNA generate defective T cells in chronic HBV infection patients[J]. J Viral Hepat, 2014,21(7):e39-47.

[18] Minami M, Daimon Y, Mori K, et al. Hepatitis B virus-related insertional mutagenesis in chronic hepatitis B patients as an early drastic genetic change leading to hepatocarcinogenesis[J]. Oncogene, 2005,24(27):4340-4348.

[19] Tamori A, Yamanishi Y, Kawashima S, et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(16):5821-5826.

[20] Saigo K, Yoshida K, Ikeda R, et al. Integration of hepatitis B virus DNA into the myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (MLL4) gene and rearrangements of MLL4 in human hepatocellular carcinoma[J]. Hum Mutat, 2008,29(5):703-708.

[21] Li S, Mao M. Next generation sequencing reveals genetic landscape of hepatocellular carcinomas[J]. Cancer Lett, 2013,340(2):247-253.

[22] Ding D, Lou X, Hua D, et al. Recurrent targeted genes of hepatitis B virus in the liver cancer genomes identified by a next-generation sequencing-based approach[J]. PLoS Genet, 2012,8(12):e1003065.

[23] Bhargava A, Khan S, Panwar H, et al. Occult hepatitis B virus infection with low viremia induces DNA damage, apoptosis and oxidative stress in peripheral blood lymphocytes[J]. Virus Res, 2010,153(1):143-150.

[24] Pollicino T, Vegetti A, Saitta C, et al. Hepatitis B virus DNA integration in tumour tissue of a non-cirrhotic HFE-haemochromatosis patient with hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2013,58(1):190-193.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560102)。

徐光華(E-mail:wdianlei@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.037

R512.6；R735.7

A

1002-266X(2017)25-0107-03

2017-02-15)