伴宮頸增大的盆腔臟器脫垂患者宮頸周圍立體環結構中膠原蛋白表達變化及機制

麥月施，夏志軍(中國醫科大學第二臨床學院，沈陽110159)

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伴宮頸增大的盆腔臟器脫垂患者宮頸周圍立體環結構中膠原蛋白表達變化及機制

麥月施，夏志軍
(中國醫科大學第二臨床學院，沈陽110159)

目的 觀察伴宮頸增大的盆臟器脫垂患者宮頸周圍立體環結構中膠原蛋白水平變化并探討其機制。方法 選擇因盆腔臟器脫垂行全子宮切除手術治療的患者40例為脫垂組，宮頸直徑>3 cm者20例，宮頸直徑≤3 cm者20例；同期因良性疾病行全子宮切除術且無盆腔臟器脫垂及尿失禁的患40例作為對照組，宮頸直徑>3 cm者20例，宮頸直徑≤3 cm者20例。選取術中切除的子宮旁靠近宮頸端的主、骶韌帶，采用免疫組化SP方法定性測量轉化生長因子β1(TGF-β1)、纖溶酶原激活劑抑制劑1(TIMP-1)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白。結果 對照組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增多(P<0.05)。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達減少(P均<0.05)，對照組宮頸直徑>3 cm者較脫垂組宮頸直徑>3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1表達減少(P均<0.05)，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 伴宮頸增大的盆腔臟器脫垂患者宮頸周圍立體環結構中膠原蛋白表達含量無明顯改變，其機制與膠原蛋白合成較少、降解增加，最終引起膠原纖維比例失調，導致子宮支持結構薄弱、子宮位置改變。

盆腔臟器脫垂；宮頸周圍立體環；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白；宮頸肥大

女性盆腔臟器脫疾病是臨床常見的一種婦科疾病，嚴重影響女性生活質量，包括盆腔臟器脫垂、尿失禁、便秘、性功能障礙及慢性疼痛等。盆腔臟器脫垂是盆底肌肉和筋膜組織薄弱導致盆腔器官下降引發的的器官位置及功能異常[1]。盆腔臟器脫垂患者通常因外陰腫物，陰道流血或排尿困難就診[2]。臨床工作中發現盆腔臟器脫垂患者常伴有子宮頸增大體征。本研究通過觀察伴宮頸增大的盆臟器脫患者宮頸周圍立體環結構中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達變化，探討其機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年3月中國醫科大學附屬盛京醫院確診盆腔臟器脫垂并行全子宮切除手術治療的患者40例(脫垂組)，宮頸直徑>3 cm者20例，年齡(54.7±8.31)歲，孕次(3.05±1.57)次，產次(1.6±0.76)次，BMI(24.52±3.01)kg/m2，宮頸直徑≤3 cm者20例，年齡(55.1±9.67)歲，孕次(3.25±1.94)次，產次(1.65±0.76)次，BMI(25.59±3.29)kg/m2。選擇同期因良性疾病(子宮肌瘤12例、子宮腺肌癥13例、宮頸上皮內瘤變CIN Ⅲ15例，排除合并盆腔臟器脫垂及尿失禁疾病)行全子宮切除手術治療的患者40例為對照組，宮頸直徑>3 cm者20例，年齡(51.2±5.78)歲，孕次(3.05±1.9)次，產次(1.35±0.74)次，BMI(23.99±3.77)kg/m2；宮頸直徑≤3 cm者20例，年齡(54.1±4.47)歲，孕次(2.45±1.23)次，產次(1.25±0.64)次，BMI(23.71±3.66)kg/m2。兩組年齡、孕產次、BMI具有可比性。兩組均排除惡性疾病、膠原疾病高雌激素疾病的干擾，近3個月未經過雌激素治療。

1.2 主、骶韌帶中 I、Ⅲ型膠原蛋白、TGF-β1、TIMP-1表達強度測定 對照組、脫垂組分別隨機選取術中切除的子宮旁靠近宮頸端的主、骶韌帶，約0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，每例2塊，放入-80 ℃的液氮瓶中保存，后固定于4%的甲醛溶液中，石蠟包埋后切片。切片脫蠟，分別將標本玻片置于二甲苯、無水乙醇、梯度乙醇中，20 min/次。PBS或蒸餾水中5 min。抗原修復，將標本玻片置于修復液(檸檬酸0.2 g+檸檬酸鈉1.5 g+500 mL蒸餾水)中，高溫(95 ℃)8 min孵育5 min,再高溫1 min孵育10 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次。封閉內源性過氧化物酶：將標本玻片置于3%過氧化氫中20 min,再用PBS沖洗5 min×3次。封閉非特異抗原：標本玻片置于5%～10%血清中20 min，后甩干后加稀釋好的一抗(Ⅰ型膠原蛋白 1∶600、Ⅲ型膠原蛋白 1∶400、TGF-β11∶200、TIMP-1 1∶150，稀釋液為PBS)過夜。染色：PBS沖洗5 min×3次，再加入二抗工作液放置于室溫中20 min，PBS沖洗5 min×3次，然后加連親和素過氧化物酶20 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB工作液鏡下顯色，待出現陽性時流水終止，蘇木素復染2 min。流水返藍10 min。脫水封片：將玻片依次置于梯度乙醇，無水乙醇，二甲苯，5 min/次，最后中性樹膠封片。結果判定標準： 按照Birner等[3]報道的方法，免疫組化結果據染色細胞的百分數和染色深度采用半定量分析法進行評分。根據陽性細胞的百分數評分：<5%計0分；<10%計1分；10%50%計2分；50%100%計3分。根據染色強度評分：不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。以上兩組評分相乘積作為表達強度。分為4級：陰性(-)為0～1分；弱陽性(+)為2～4分；中陽性(++)為5～8分；強陽性(+++)為9～12分。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，計數資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、TIMP-1均為分泌蛋白，分布于細胞質中，除此之外，TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白還分布于細胞外基質中。對照組中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、TGF-β1、TIMP-1均可見顏色較背景顏色深，呈黃色至深黃色，分布較密集。脫垂組顏色較背景顏色淺，呈淡黃色或淺色，分布稀疏、散亂。對照組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅰ型膠原蛋白表達強度-、+、++、+++者分別為0、4、14、2例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、2、9、9例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅰ型膠原蛋白表達強度-、+、++、+++者分別為2、10、8、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、6、14、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅲ型膠原蛋白 表達強度-、+、++、+++者分別為0、6、10、4例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、2、8、10例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅲ型膠原蛋白表達強度-、+、++、+++者分別為2、15、3、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、8、12、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中TGF-β1表達強度-、+、++、+++者分別為0、4、13、3例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、1、11、8例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中TGF-β1表達強度-、+、++、+++者分別為3、15、2、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為1、10、9、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中TIMP-1表達強度-、+、++、+++者分別為0、4、10、6例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、3、3、14例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中TIMP-1表達強度-、+、++、+++者分別為3、15、2、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、11、8、1例。對照組宮頸直徑>3 cm與≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達差異有統計學意義(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm與≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達差異有統計學意義(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達減少(P均<0.05)，對照組宮頸直徑>3 cm者較脫垂組宮頸直徑>3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較對照組宮頸直徑≤3cm者TGF-β1、TIMP-1表達減少(P均<0.05)，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達差異無統計學意義(P均>0.05)。

3 討論

膠原蛋白被認為是一種生物力學強度的主要因素，人體中發現有28種膠原蛋白，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白擁有較好的拉力和彈力[3,4]。Ⅰ型膠原蛋白為最豐富的形式，占70%。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是結締組織的主要成分，Ⅲ型膠原蛋白在疏松結締組織中常見，構成陰道壁的外膜和盆腔器官的周圍結構。異常或合成的膠原蛋白及退化可能會致陰道壁脫垂[5]。膠原蛋白通過纖連蛋白與蛋白聚糖連接在一起，分子間有廣泛的交聯，分子間相互交織，構成了多層次，多維的復雜的空間結構。由此兼備抗壓力、韌性及彈性為一體的功能。

TGF-β1是一類多功能的肽類生長因子，有促進成纖維細胞生長、增殖及ECM 合成的作用。TGF-β1是促進膠原蛋白分化合成的重要因子[6]。TGF-β1主要促進以間質蛋白為主的膠原蛋白合成，增加膠原蛋白的表達及Ⅰ型膠原蛋白的穩定性。

膠原蛋白的降解通過膠原酶的含量體現，通常膠原酶在組織中含量較低，但在結締組織降解情況下容易激活，形成活躍狀態。膠原酶被激活后，降解Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的能力增強，使得膠原蛋白的降解增多。TGF-β1可抑制MMP的分泌及刺激TIMP-1的活性從而抑制膠原蛋白的降解。TIMP-1通過抑制MMP的活性而抑制Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的降解。由此可知TGF-β1、TIMP-1均可通過抑制MMP的活性而抑制膠原酶的活性，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的降解。

宮頸周圍立體環即宮頸周圍3～4 cm內的相關解剖結構和組織的總稱，是一個球形的立體結構。其主要包括三條韌帶，七個間隙，神經，血管及陰道兩側的結締組織。三大韌帶即主韌帶、骶韌帶、陰道旁組織復合體[7]。其中主、骶韌帶復合體屬于陰道支持結構的三個水平理論中的頂端支持結構，屬于第一水平，由 Delancey[8]于1994年提出。主、骶韌帶是女性盆底主要的支持結構，韌帶中的膠原蛋白是維持子宮在盆腔中位置的最主要的支持元素，維持中盆腔的結構和功能，防止子宮脫垂或后穹窿脫垂(子宮切除術后)[9]。主、骶韌帶富含結締組織，以膠原蛋白為主，Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是結締組織的主要成分。膠原蛋白被認為是一種生物力學強度的主要因素，人體中發現有28種膠原蛋白，其中主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[10]。膠原蛋白粗大，排列緊密，聚集成粗細不等的束，呈波浪形，彼此交織吻合，具有一定的韌性和穩固性，對維持子宮頸在盆腔中的正常解剖位置有重要作用。Ⅰ型膠原蛋白無彈性并提供巨大的耐拉力。Ⅲ型膠原蛋白有彈性，提供很強的靈活性。Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白按比例結合，提供穩固的拉力和彈力系統，維持盆底的結構和支持功能。

本研究結果顯示，對照組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增加，宮頸外觀表現增大與膠原蛋白合成增加有關。TGF-β1、TIMP-1增加，促進膠原蛋白的合成，同時抑制膠原酶對膠原蛋白的降解。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1 、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達下降。首先，TGF-β1表達下降，膠原蛋白合成降低。其次，TGF-β1對TIMP-1的刺激減弱，致使其活性減弱，對MMP的活性的抑制下降，所以MMP-9活性增加，使得MMP-9/TIMP比例失調，對膠原酶活性的抑制下降。膠原酶原激活，膠原酶活性升高，膠原蛋白降解增加。膠原蛋白減少影響第一水平結構彈性、韌性及抗壓能力，易引起子宮脫垂。本研究結果顯示，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達差異無統計學意義。但脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者比較，TIMP1、TCF-β1含量降低，刺激膠原蛋白合成的能力下降。同時活化MMP的能力減弱，抑制膠原酶活性的能力減弱，膠原酶原被激活，活性增加，降解膠原蛋白能力增加。Ⅲ型膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白合成逐漸減少，降解逐漸增多，但總體表達量與對照組比較無統計學差異。表明機體尚處于一種抗衡的狀態，膠原蛋白表達含量尚未下降。機體需經歷一段長時間的抗衡過程，膠原蛋白表達比例失調，最終走向失衡引起膠原蛋白含量下降。膠原蛋白結構及比例改變，易致第一水平支持力量逐漸削弱，對子宮的支持力量減弱，引起中盆腔缺陷。

綜上所述，伴宮頸增大的盆臟器脫垂患者宮頸周圍立體環結構中膠原蛋白表達含量無明顯改變，其機制與膠原蛋白合成減少，降解增加，膠原比例失調引起盆腔支持結構薄弱，從而引起子宮位置改變。

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科技部國家科技支撐計劃課題(2014BAI05B02)。

夏志軍(E-mail:xiazj@sj-hospital.org)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.034

R681.6

B

1002-266X(2017)25-0098-03

2016-10-20)