VEGF-C在口腔頜面部淋巴管瘤組織中表達變化及其對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

王國云，楊旭，徐天舒

(常州市第一人民醫院，江蘇常州213000)

VEGF-C在口腔頜面部淋巴管瘤組織中表達變化及其對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

王國云，楊旭，徐天舒

(常州市第一人民醫院，江蘇常州213000)

目的探討血管內皮生長因子C(VEGF-C)在口腔頜面部淋巴管瘤(OML)發生、發展中的作用。方法收集OML組織(OML組)和瘤旁正常組織(Control組)各54例份，采用qRT-PCR法檢測組織中VEGF-C mRNA相對表達量，采用免疫組化法檢測VEGF-C蛋白陽性表達率。將體外培養的人臍靜脈內皮細胞ECV304隨機分為兩組，分別轉染sh-VEGF-C質粒(觀察組)和對照質粒sh-control(對照組)，轉染48 h時，分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量，采用MTT法檢測細胞增殖能力(以吸光度值表示)。結果OML組與Control組VEGF-C mRNA相對表達量分別為1.061±0.284、0.801±0.098，VEGF-C蛋白陽性表達率分別為84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，兩組比較P<0.05或<0.01。觀察組與對照組VEGF-C mRNA相對表達量分別為0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相對表達量分別為0.319±0.021、0.965±0.039，吸光度值分別為0.393±0.015、0.975±0.004，兩組比較P均<0.01。結論VEGF-C在OML組織中高表達；降低VEGF-C表達可抑制人靜脈內皮細胞增殖。

口腔頜面部淋巴管瘤；血管內皮生長因子C；人臍靜脈內皮細胞；細胞增殖

口腔頜面部淋巴管瘤(OML)是高發于面部皮膚、口腔黏膜及皮下組織等頭頸部多個部位的淋巴管病變，在兒童中發病率較高[1]。淋巴管的形成由多種促進因子和抑制因子共同調控，兩者平衡一旦被打破，內皮細胞數量發生改變，可能導致淋巴管瘤或脈管畸形[2]。惡性腫瘤轉移與增殖常依賴于淋巴管的轉運。血管內皮生長因子C(VEGF-C)是重要且特異的促淋巴管形成內皮生長因子，已被證實在多種惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌中異常表達，與腫瘤轉移和惡性進展密切相關[3,4]。目前關于VEGF-C與OML的關系鮮見報道。為此，我們于2015年7月～2016年12月進行了本研究，旨在探討VEGF-C在OML發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①組織樣本：收集我院病理科存檔的54例OML患者的瘤組織標本(OML組)及瘤旁正常組織標本(Control組)。OML患者男27例、女27例，年齡0.3～32(11.4±10.5)歲，口腔頜面部毛細管型淋巴管瘤、海綿狀淋巴管瘤和囊腫淋巴管瘤各18例。患者術前均未接受硬化等治療。②細胞：人臍靜脈內皮細胞ECV304，中國科學院上海生命科學院生化與細胞生物學研究所。將ECV304細胞置于含10% FBS的RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱內孵育。當細胞融合度達80%～90%時收集細胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養基稀釋，制備密度為5×104個/mL的細胞懸液，按每孔2 mL接種至6孔板。細胞融合至60%～80%時隨機分為兩組，分別轉染質粒sh-VEGF-C(觀察組)及sh-control(對照組)。③主要試劑：兔抗人VEGF-C單抗和兔抗人GAPDH多抗(美國CST公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；VEGF-C抑制性慢病毒載體質粒sh-VEGF-C及對照空載體質粒sh-control(美國GeneCopoeia公司構建)；Lipofectamine 2000轉染試劑、TRIzol(美國Invitrogen公司)，TaqMan逆轉錄試劑盒(美國Life Technologie公司)，qSYBR-Green-containing PCR kit試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，兩步法免疫檢測試劑盒(美國Dako公司)，MTT細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒(美國Sigma公司)。

1.2 組織標本VEGF-C表達檢測 ①VEGF-C mRNA表達檢測：采用qRT-PCR法。取OML組和Control組標本，TRIzol法提取RNA，逆轉錄生成cDNA；以cDNA為模板，參照qRT-PCR說明書進行PCR擴增，檢測CT值。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算VEGF-C mRNA相對表達量。②VEGF-C蛋白表達檢測：采用免疫組化法。取OML組和Control組標本，常規石蠟包埋后切片，梯度乙醇脫蠟。抗原修復，血清封閉，滴加VEGF-C抗體(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min；顯色劑顯色后蘇木精復染，中性樹膠封片；顯微鏡下(×200)采集圖像。VEGF-C蛋白主要表達于細胞質，以陽性細胞在全部細胞中所占比例和陽性細胞染色強度綜合判定結果：A：陽性細胞數<1/3為1分，1/3～<2/3為2分，≥2/3為3分；B：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。A×B=0判斷為-，1～2為+，3～4為++，5～9為+++。+、++、+++均為陽性，統計陽性表達率。

1.3 細胞VEGF-C表達及細胞增殖能力檢測 ①VEGF-C mRNA表達：采用qRT-PCR技術。TRIzol法提取穩定轉染48 h的觀察組和對照組細胞RNA，檢測VEGF-C mRNA相對表達量，具體步驟參照1.2中①。②VEGF-C蛋白表達：采用Western blotting法。取穩定轉染48 h的觀察組和對照組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本進行10% SDS-PAGE。將蛋白轉移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶1 000的兔抗人VEGF-C和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜后TBST洗膜，1∶2 000羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL發光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描，保存條帶圖片。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值和內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。③細胞增殖能力：采用MTT法。將穩定轉染48 h的觀察組和對照組細胞接種到96孔板，當細胞融合至接近90%時，每孔加入滅菌MTT液30 μL(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h；每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min；采用酶標儀檢測570 nm波長處各孔吸光度(A)值。

2 結果

2.1 OML組與Control組VEGF-C表達比較 OML組與Control組VEGF-C mRNA相對表達量分別為1.061±0.284、0.801±0.098，兩組比較P<0.05。VEGF-C蛋白陽性表達主要定位于細胞質，少量見于細胞膜，OML組及Control組VEGF-C蛋白陽性表達率分別為84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組與對照組VEGF-C表達及細胞增殖能力比較 觀察組與對照組VEGF-C mRNA相對表達量分別為0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相對表達量分別為0.319±0.021、0.965±0.039，A值分別為0.393±0.015、0.975±0.004，兩組比較P均<0.01。

3 討論

OML是由淋巴管擴張或增生而成的口腔頜面部常見良性腫瘤，可造成由內皮細胞排列的管腔內充滿大量淋巴液，且一般不會自行消退[5,6]；臨床上多采用冷凍治療、硬化治療、放療、化療或手術治療等，以手術治療為主。近年來平陽霉素瘤內注射，同時針狀型微波輻射器刺入瘤內熱凝等方法應用于治療OML，雖治療效果明顯提升，但易導致內皮增生等多種不良反應[7,8]。血管新生及內皮增生均需要多種生長因子和細胞因子的共同作用才可實現，其中VEGF家族可直接或間接調控血管或淋巴管生成，提高血管通透性并誘導內皮細胞分裂和增殖[9]。VEGF是目前促血管生成作用最為顯著的生長因子，為多功能的細胞因子家族，其家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子(PIGF)。其中VEGF-C在人類胚胎組織及成熟組織中均存在，其分布特點是外周血白細胞、胸腺、肝臟和腦中表達量較低，心臟、卵巢、胎盤和小腺體中表達量較高[10,11]。

本研究結果顯示，OML組織中VEGF-C mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率均顯著高于正常組織，即VEGF-C在OML患者瘤組織中高表達，提示VEGF-C高表達促進OML的發生[12,13]。ECV304細胞可通過自發轉化獲得，細胞生長時呈單層鵝卵石狀，具有接觸抑制效應，且培養時不需要添加任何特殊的生長因子即可獲得良好的生長狀態，是理想的OML研究模型。本研究分別轉染VEGF-C的抑制質粒sh-VEGF-C及其對照質粒sh-control到ECV304細胞中，MTT法檢測細胞增殖能力，結果顯示抑制VEGF-C表達可顯著降低ECV304細胞的增殖能力，提示VEGF-C具有抑制細胞增殖、促進血管內皮細胞有絲分裂的作用[14]。VEGF及血管內皮生長因子受體(VEGFR)可構成VEGF/VEGFR生物軸，該生物軸由多重受體和配體相互疊加構成，由于受體和配體的結合具有專一性，因此不同細胞中VEGF/VEGFR表達和功能各不相同，VEGF信號被激活時，可觸發信號通路的網狀傳導，最終促進血管內皮細胞生長、增殖及轉移[15]。因此，在VEGF-C信號被抑制時其下游信號通路的傳導也被阻斷，從而抑制血管內皮細胞生長增殖。

綜上所述，VEGF-C在OML組織中高表達；抑制VEGF-C表達可抑制人靜脈內皮細胞增殖。VEGF-C高表達可能參與了OML的發生、發展。

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ExpressionofVEGF-Cinoralandmaxillofaciallymphangiomaanditseffectonproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcells

WANGGuoyun,YANGXu,XUTianshu

(ChangzhouFirstPeople′sHospital,Changzhou213000,China)

ObjectiveTo explore the expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in the occurrence and development of oral and maxillofacial lymphangioma (OML).MethodsThe tumor tissues (OML group) and the adjacent normal tissue (control group) from OML patients were collected. The real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of VEGF-C mRNA in the tissues. Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the positive rate of VEGF-C protein expression in the tissues. ECV304 cells cultured in vitro were randomly divided into two groups: the observation group which was transfected with sh-VEGF-C plasmid and the control group transfected with control plasmid sh-control. After 48-hour transfection, qRT-PCR and Western blotting were used to detect the relative expression of VEGF-C protein, and MTT assay was used to detect the proliferation of the cells (absorbance value).ResultsIn the OML group and control group, the expression of VEGF-C mRNA was 1.061±0.284 and 0.801±0.098, respectively; the positive expression rates of VEGF-C protein was 84.10% (42/54) and 10.13% (5/54), respectively (P<0.05 orP<0.01). In the observation group and control group, the relative expression levels of VEGF-C mRNA were 0.200±0.058 and 0.967±0.017, respectively; the relative expression levels of VEGF-C protein were 0.319±0.021 and 0.965±0.039, respectively; the A values were 0.393±0.015 and 0.97±0.004, respectively; significant differences were found between these two groups (allP<0.01).ConclusionsVEGF-C is highly expressed in the OML tissues, and decreasing VEGF-C can inhibit the proliferation of human umbilical vein endothelial cells.

oral and maxillofacial lymphangioma; vascular endothelial growth factor-C; human umbilical vein endothelial cells; cell proliferation

江蘇省科學技術獎資助項目(2016562)。

王國云(1980-)，男，主治醫師，研究方向為口腔頜面部腫瘤整復治療。E-mail： chenzehui9578@qq.com

楊旭(1983-)，男，主治醫師，研究方向為口腔頜面部惡性腫瘤整復治療。E-mail： lihunzhinan@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.007

R739.81

A

1002-266X(2017)44-0026-03

2017-07-05)