骨髓間充質干細胞靜注對堿燒傷兔角膜修復的促進作用及機制

孫紅，喬麗萍，侯世科，趙少貞，孫惠敏，袁佳琴，韓泉洪

(1 天津醫科大學眼科臨床學院，天津市眼科醫院，天津300020；2武警后勤學院附屬醫院；3天津醫科大學眼科中心)

骨髓間充質干細胞靜注對堿燒傷兔角膜修復的促進作用及機制

孫紅1，喬麗萍2，侯世科2，趙少貞3，孫惠敏3，袁佳琴3，韓泉洪1

(1 天津醫科大學眼科臨床學院，天津市眼科醫院，天津300020；2武警后勤學院附屬醫院；3天津醫科大學眼科中心)

目的 觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)靜注對堿燒傷兔角膜修復的促進作用并探討其機制。方法 取新西蘭大白兔60只，制備右眼角膜緣堿燒傷模型，隨機分為觀察組和對照組，各30只(30眼)。觀察組耳緣靜脈注射BMSCs細胞懸液3.47×106個/kg，對照組注射等體積PBS。注射后第3、21、60天，兩組行右眼角膜透明度和角膜上皮再生狀況評分，采用裂隙生物顯微鏡觀察角膜血管新生情況，計算角膜新生血管面積。結果 第3、21、60天觀察組角膜上皮再生程度評分均低于對照組(P均<0.05)。第3天兩組角膜混濁程度評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，第21、60天觀察組均低于對照組(P均<0.05)。觀察組第3、21天角膜新生血管面積大于對照組(P均<0.05)，第60天小于對照組(P均<0.05)。結論BMSCs靜注可促進堿燒傷兔角膜的修復，提高角膜透明度；其機制可能與其早期促進損傷角膜新生血管生成、晚期抑制角膜新生血管生成有關。

角膜修復；堿燒傷；骨髓間充質干細胞；新生血管生成；兔

骨髓間充質干細胞(BMSCs)存在于骨髓中，是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，亦是能分泌多種細胞因子的較原始骨髓基質細胞，具有基質細胞的特性。在適宜的培養條件下，BMSCs可增殖并被誘導分化為包括骨、軟骨、肌肉、脂肪、神經等組織細胞，是組織工程良好的種子細胞[1～3]。BMSCs可取自自體骨髓，取材方便，由其誘導而來的組織在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥等問題，常作為組織工程的種子細胞用于修復組織缺損[4]；但其靜脈應用對堿燒傷角膜修復作用的報道鮮見。為此，我們于2015年6月～2016年12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔60只，體質量(1.5±0.6)kg，月齡2個月，雌雄不分，健康無任何眼疾。兔BMSCs為我實驗室自制。制備方法：取1 個月齡體重0.5～1.0 kg新西蘭大白兔1 只, 肌注快速眠0.1 mL麻醉。無菌操作下穿刺股骨骨髓腔,抽出骨髓5～8 mL。DF12稀釋后，直接接種于含有20 %胎牛血清的DF12 培養液中,于37 ℃、5 %CO2、飽和濕度下培養。每48 h更換一次培養液。收集第二代或第三代細胞備用。

1.2 角膜堿燒傷模型制備及分組處理 將60只兔麻醉后制備角膜堿燒傷模型[5]：將浸透1 mol/L氫氧化鈉溶液的濾紙環片(內徑8 mm，外徑14 mm)置于兔右眼角膜緣上45 s，再用生理鹽水沖洗5 min。結果顯示，角膜堿燒傷程度均在Ⅲ級以上，造模成功。籠養24 h后用隨機雙盲法(編號，查表法)分為觀察組和對照組，各30只(30眼)。 觀察組麻醉后耳緣靜脈注射BMSCs細胞懸液3.47×106個/kg。對照組經耳緣靜脈靜注等體積PBS。兩組均用氟哌酸眼液滴眼，4次/d；結膜囊涂四環素眼膏，1次/晚。

1.3 相關指標觀察 第3、21、60天兩組各分別行空氣栓塞處死10只兔，取完整角膜組織觀察以下指標。

1.3.1 角膜上皮再生程度 角膜組織行熒光素鈉染色，按角膜染色面積進行評分：角膜無著色為0分，染色面積≤1/4象限計1分，染色面積>1/4～≤1/2象限計2分，染色面積>1/2～≤3/4象限計3分，染色面積>3/4象限計4分。

1.3.2 角膜透明度 采用裂隙顯微鏡觀察角膜透明度，角膜透明無混濁為0分，輕度混濁且虹膜紋理可見計1分，中度混濁且虹膜紋理不清計2分，重度混濁隱見瞳孔計3分，極重度混濁且瞳孔不見計4分。

1.3.3 角膜新生血管面積 計數自角鞏緣長出、連續彎曲度小、朝向植入物最長血管(即新生血管)的長度和數量；計算其面積。角膜新生血管生長面積(mm2)=C/12×3.141 6[r2-(r-L)2]。C為發生新生血管的角膜圓周鐘點數，r為角膜半徑，L為血管長度。

2 結果

2.1 兩組不同時間角膜上皮再生評分比較 觀察組及對照組第3天角膜上皮再生評分分別為(2.9±0.45)、(3.5±0.56)分，第21天分別為(2.7±0.39)、(3.8±0.47)分，第60天分別為(2.1±0.43)、(3.9±0.51)分。觀察組第3、21、60天均低于對照組(P均<0.05)。

2.2 兩組不同時間角膜混濁程度評分比較 觀察組及對照組第3天角膜混濁程度評分分別為(2.8±0.2)、(2.9±0.3)分，兩組比較P>0.05；第21天分別為(2.7±0.4)、(3.1±0.2)分，第60天分別為(1.9±0.3)、(3.5±0.4)分；第21、60天均低于對照組(P均<0.05)。

2.3 兩組不同時間角膜新生血管面積比較 觀察組及對照組第3天角膜新生血管面積分別為(12.56±0.46)、(3.34±0.51)mm2，第21天分別為(19.16±0.76)、(14.56±0.46)mm2，第60天分別為(4.36±0.66)、(29.16±0.68)mm2。第3、21天觀察組高于對照組(P均<0.05)，第60天低于對照組(P均<0.05)。

3 討論

在角膜緣堿燒傷早期，如果建立良好的角膜緣血管網的血液供應，可為角膜修復提供充分的氧氣和營養，阻斷角膜發生進一步損傷。角膜緣化學損傷的預后與角膜緣缺血的嚴重程度有直接關系[6]。研究發現，角膜緣堿燒傷早期組織分泌促血管新生因子的能力缺陷，組織炎癥及缺血缺氧誘發的新生血管形成可導致角膜瘢痕、瞼球粘連[8]。故此期急救措施中首先要積極改善角膜血管供養狀態[7]。因組織炎癥及缺血缺氧誘發的新生血管形成可在角膜形成瘢痕，引起瞼球粘連[8]。

最初認為，缺血誘導的血管重建僅僅依賴于缺氧、炎癥介導的血管新生過程。但最近的研究發現，出生后的血管重建不僅依賴于血管新生，還需骨髓來源的前體干/祖細胞的參與[9]。胚胎發育中的血管生成是指由中胚層衍生的血管干細胞遷移、聚集、分化在原位形成原始毛細血管網[10]，而成體骨髓來源的內皮祖細胞能夠趨化、黏附、增殖、分化成內皮細胞并參與血管的重建，這一過程類似于胚胎發育過程中的血管生成，所以被稱為出生后或成體的血管生成[11]。后來發現有許多生長因子如粒細胞巨核細胞集落生長因子(GM-CSF)、VEGF等能夠募集骨髓來源的干細胞到血管重建所需的部位。而缺血本身不僅能增加血管干細胞的數量，且能夠增強干細胞向內皮細胞分化的能力[12]。但缺血誘導的血管重建往往不能完全彌補外周血管病變和動脈閉塞所引起的血流減少，而提供外源性干細胞可增強血管生成，并促進缺血組織的血流恢復。

與血管新生不同，動脈生成的調控不依賴于局部的缺氧，但局部的血流剪切力以及局部內皮活化卻發揮著至關重要的作用[13]。動脈生成也稱為側支循環建立，即原先存在的潛在血管在血流壓力的作用下增殖生長，形成較粗的能顯著促進血流的大動脈[14]。在此過程中，血管平滑肌細胞和周細胞扮演著重要角色，其能調節血流量和血管壁的通透性，促進血管生長；還能通過分泌細胞因子傳遞信號給內皮和作用于細胞外基質[15]等。側支循環建立后，內皮細胞表達單核細胞趨化因子和單核細胞黏附分子等[16]。單核巨噬細胞、血小板、肥大細胞以及其他細胞被趨化因子(如VEGF)趨化到炎癥和缺血部位[17]。這些細胞能產生促血管新生和促血管生成的因子，如VEGF、成纖維細胞生長因子、IL-8、血小板衍生生長因子等，這些因子反過來吸引更多的內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、白細胞和血小板[18]。這樣的一個新環境導致內皮細胞和平滑肌細胞大量增殖、遷移，血管增粗和成熟，細胞外基質的大量合成。最終，小血管重塑形成大的側支循環，從而提供有效血流量，促進缺血角膜再生[19,20]。

研究發現，在血管新生過程中動脈生成和血管新生常同時發生、發展，不能絕對分開[21]；循環中注射骨髓干/祖細胞的兔血管新生起主要作用[22]。BMSCs既能在VEGF刺激下分化成內皮細胞，也能在PDGF作用下形成平滑肌細胞。在細胞水平上，骨髓來源的干/祖細胞能分化為毛細血管的內皮細胞(血管新生)，亦可形成由平滑肌細胞包被的大血管(血管生成)。盡管這兩種機制存在著許多交迭，但目前尚無法明確區分其分子過程。BMSCs對血管新生、血管生成、動脈生成作用的區分也很不清楚。目前所知的細胞生成因子均不是僅對血管重建發生作用；內皮細胞和周細胞/平滑肌細胞的接觸在血管成熟中起著尤為重要的作用。如果沒有周細胞/平滑肌細胞的參與，新生的裸露內皮細胞管狀結構很不穩定，容易退縮和消失。前期研究中我們發現，移植的BMSCs可參與到血管網中并分泌VEGF[2]；外周血和房水中的VEGF濃度變化以及角膜組織中VEGF、VEGFR基因表達水平均證實了上述發現。VEGF能刺激周細胞/平滑肌細胞增殖和募集，進而促進血管生長和成熟。本研究觀察組第3、21、60天角膜上皮再生程度評分均低于對照組，第21、60天角膜混濁程度評分均低于對照組。說明靜注BMSCs可促進損傷角膜再生，提高角膜透明度。觀察組注射BMSCs第3、21天角膜新生血管面積高于對照組，表明靜注BMSCs可促進堿燒傷角膜損傷后早期血管新生，進而改善燒傷后早期角膜血供。第60天觀察組右眼角膜新生血管面積小于對照組，說明在損傷后期，觀察組血管新生程度較低，此可能為觀察組右眼角膜透明度較高的原因之一。

綜上所述，BMSCs靜注可促進堿燒傷兔角膜修復，提高角膜透明度；其機制可能為早期可促進損傷角膜新生血管生成、晚期可抑制角膜新生血管生成。本研究的不足為未對角膜緣組織中的周細胞/平滑肌細胞進行抗體標記。

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韓泉洪(E-mail：hanquanhong126@126.com)

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R772.2

A

1002-266X(2017)20-0040-03

2016-11-11)