原發性PD患者SMPD1基因3、4號外顯子突變及其臨床意義

馬艷，宋娜，牛建一，丁剛

(1 濰坊醫學院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫院；3 濰坊醫學院附屬益都中心醫院)

原發性PD患者SMPD1基因3、4號外顯子突變及其臨床意義

馬艷1，宋娜2，牛建一3，丁剛3

(1 濰坊醫學院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫院；3 濰坊醫學院附屬益都中心醫院)

目的 探討SMPD1基因3、4號外顯子突變與原發性帕金森病(PD)的關系。方法 選擇臨床確診的原發性PD患者103例(PD組)、體檢健康者103例(對照組)，按照SMPD1基因序列和相關文獻設計引物，采用PCR技術對SMPD1基因3、4號外顯子進行擴增，并將PCR產物進行序列測序和突變分析。結果 經對測序結果序列比對發現，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。其中，PD組SMPD1基因p.A402T位點突變概率為11.65%(12/103)，對照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。生物信息學分析顯示，該突變導致其編碼的溶酶體酶SMase穩定性降低。Mutation Taster和PolyPhen2軟件檢測結果顯示，SMPD1基因存在p.A402T位點致病性突變。結論 原發性PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點突變，該位點突變可能增加PD的發病風險。

帕金森病；SMPD1基因；p.A402T突變

帕金森病(PD)又稱震顫性麻痹，是一種僅次于阿爾茨海默病的常見神經退行性疾病，多見于60歲以上老年人。其臨床癥狀主要表現為靜止性震顫、行動遲緩、肌強直和姿勢不穩[1]。現已證實，原發性PD(本研究以下稱PD)的發病與某些基因突變有關。在德系猶太人群中LRRK2、GBA初始突變與PD的發病關系密切，而LRRK2基因p.G2019S和GBA初始突變的概率分別為15%、20%[2，3]。SMPD1基因突變最早報道能夠引起一種常染色體隱性遺傳性溶酶體貯積病——尼曼匹克病。最近研究發現，SMPD1基因突變可引起溶酶體功能喪失，導致體內的α突觸核蛋白聚合和路易小體沉積，從而導致PD[4，5]。在猶太人群中，PD的發病與SMPD1基因p.L302P[4]、c.996delC(fsP330)[6]位點突變有關，特別是p.L302P位點，但在中國人群中并未發現p.L302P位點突變[5,7]；另有研究發現，在中國人群中SMPD1基因p.R591C位點突變和Leu-Ala(Val)重復變異與PD的發病有關[8,9]。以上研究提示，PD可能在不同區域、不同種族中具有遺傳異質性。本研究分析103例PD患者SMPD1基因3、4號外顯子突變情況，旨在為進一步尋找中國PD患者SMPD1基因外顯子上可能的致病突變位點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2016年6月聊城市人民醫院和益都中心醫院收治的PD患者103例(PD組)，其中，男67例、女36例，發病年齡50～78歲(66.5±11.39)歲。PD均為散發；其診斷符合英國BrainBank標準[10]：運動遲緩且至少具備肌強直、靜止性震顫或姿勢平衡障礙(并非由于原發的視覺、前庭、小腦或本體感覺造成)中的一項。排除繼發性PD、帕金森疊加綜合征和其他神經系統疾病，甲亢及其他遺傳性疾病。同期另選與PD組性別、年齡匹配的體檢健康者103例(對照組)，男67例、女36例，年齡(65.4±12.1)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經過醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 SMPD1基因3、4號外顯子測序及突變分析

1.2.1 DNA提取 收集所有研究對象肘正中靜脈血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，混勻，置于-80 ℃冰箱保存。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，然后將提取的DNA溶于50～100 μL無菌ddH2O中。NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增 查詢文獻[11]設計SMPD1基因3、4號外顯子擴增引物，并根據SMPD1基因序列(GenBank NC 000011.10)進行修正，兩個外顯子通用一個引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-ACTGTGAGCTCCTTGCAGGT-3′，下游引物：5′-TGCTCAAGGGAATTTTCAGC-3′，擴增產物片段長度667 bp。PCR反應體系共25 μL：Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR緩沖液(含有MgCl2)2.5 μL和2.5 mmol/L dNTP 1 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃充分延伸5 min。

1.2.3 PCR產物基因測序 取PCR產物5 μL+6×Loading Dye 1 μL混勻，行1%瓊脂糖凝膠電泳，D100Marker作為標準對照。紫外分光光度計確認擴增產物質量，將質量符合要求(條帶大小正確，無雜帶)的未純化PCR產物委托上海生工生物工程股份有限公司進行基因突變測序。

1.2.4 基因序列比對 采用NCBI網站提供的Blast軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。根據比對結果判別基因有無突變。

1.2.5 生物信息學分析 采用SIFT(Scale Invariant Feature Transform，http://sift.jcvi.org/)、I-Mutant2.0(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)和MUpro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)進行生物信息學分析，檢驗SMPD1基因上新的突變點對其編碼的溶酶體酶SMase穩定性的影響。使用Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)和PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)檢測突變點的致病性。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。基因頻率和基因型分析采用基因計數法，計數資料以比例和率(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果 PCR擴增產物的電泳條帶呈單一明亮條帶且清晰無雜質，目的條帶大小為667 bp。見插頁Ⅳ圖6。

2.2 PCR產物測序突變分析 基因庫中SMPD1基因p.A402T位點共有3種基因型：GG(野生純合子)、GA(雜合子突變)、AA(純合子突變)。經對測序結果序列比對發現，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。見插頁Ⅳ圖7。其中PD組SMPD1基因p.A402T位點突變概率為11.65%(12/103)，對照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。

2.3 生物信息學分析 SMPD1基因p.A402T突變很可能編碼的溶酶體酶SMase穩定性降低(在I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件上完成)，影響蛋白質的功能(在SIFT軟件上完成)。Mutation Taster軟件檢測結果顯示，SMPD1基因p.A402T存在致病突變位點；PolyPhen2軟件檢測結果顯示，HumDiv為0.999，HumVar為0.939。見插頁Ⅳ圖8、表1。

表1 SMPD1基因突變的軟件預測情況

注：SIFT得分<0.05為有害突變；PolyPhen2得分越接近1，突變致病性越高。

3 討論

PD是一種以運動障礙為主要表現的神經系統變性疾病，其主要病理學特征是黑質致密部多巴胺能神經元進行性變性和脫失，以及細胞內以泛素和α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體的形成。迄今為止，PD的病因和發病機制尚未完全清楚，越來越多的研究認為，遺傳因素在其發病中具有重要作用。據GWAS報道，很多易感基因或候選基因可導致PD的發病風險升高[12,13]，這些易感基因或候選基因通過不同路徑損害細胞的新陳代謝。在PD發病機制中，細胞的溶酶體自我吞噬通路(ALP)即是其中的一種重要途徑[14]。多巴胺能神經元胞質中異常蛋白質的積累可能是由于正常ALP通路功能紊亂引起，最終導致細胞凋亡和PD的臨床表現。GBA和SMPD1編碼的溶酶體酶在維持ALP通路的正常功能方面具有重要作用[14,15]。有研究已發現，SMPD1基因p.L302P位點突變使PD的發生率提高了9倍[4]，此為ALP通路在PD發病機制中的作用提供了額外證據。

SMPD1基因位于11p15.1～p15.4，全長共4 685 bp，包含6個外顯子和5個內含子。其編碼產物是由629個氨基酸組成的鞘磷脂酸性二酯酶1(SMase)，其是一種溶酶體酶，可裂解鞘磷脂膽堿磷酸頭基，由此生成的神經酰胺在壓力條件下作為第二信使啟動凋亡反應。溶酶體是降解α突觸核蛋白的主要的細胞器[16]，PD的病理特點是蛋白質(以α突觸核蛋白為主)聚集形成路易小體[17]。SMPD1與GBA均是溶酶體基因，GBA和SMPD1基因編碼的溶酶體分解酶GCase和SMase是否以類似的方式參與PD的發病機制尚無定論。有研究發現，他們有一個共同特點，即酶法分解的最終產物均是神經酰胺。神經酰胺代謝途徑缺失能改變溶酶體酶的性能和功能，從而導致α突觸核蛋白的積累和路易小體的形成，繼而導致PD發病。PANK2和PLA2G6基因參與神經酰胺引起的神經退行性疾病(PANK2和PLA2G6分別引起1型和2型大腦鐵沉積性神經退行性變)，其中也有路易小體的形成[16]，進一步證實上述結論。

近年研究發現，GBA突變可引起葡萄糖神經酰胺的聚集，從而阻止α突觸核蛋白的降解，集聚的α突觸核蛋白可促進其低聚物形成和神經毒性作用[17,18]；α突觸核蛋白積累可阻礙GCase從內質網到溶酶體的轉運，進一步損害溶酶體GCase的活性，從而增加路易小體的形成。因此，GCase活性的喪失創建了一個溶酶體功能減弱和α突觸核蛋白積累的正反饋回路，最終導致神經退化。與GCase缺乏類似，SMase缺乏與α突觸核蛋白相互作用從而促進神經毒性，繼而導致PD的發展。

本研究在SMPD1基因上發現了一個新的突變點p.A402T，即該基因402號位點上的丙氨酸被蘇氨酸取代，從而改變了其編碼的蛋白質酶作用和活性。SIFT系統表明，該突變能夠改變蛋白質的功能，I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件對SMPD1基因p.A402T突變的評估亦支持上述結論。表明SMPD1基因p.A402T位點突變能夠降低SMase的穩定性，該位點突變具有致病性。此外，本研究在PD患者中發現在尼曼匹克病中未出現過的p.A402T突變，這可能與篩選的中國尼曼匹克病病例數量有限有關。SMPD1突變引起的PD并不伴有獨特的PD臨床特點，其臨床表現與GBA以及其他基因突變攜帶者表現相似。目前無法估計SMPD1基因突變在全世界PD發病機制中的作用，但這個發現為進一步了解PD潛在的發病機制具有重要意義。

綜上所述，PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點突變，該位點突變可能增加PD的發病風險。今后我們將加大樣本對SMPD1基因進行檢測，并對p.A402T位點進一步研究，為PD發病機制和治療提供新的線索和潛在的藥物作用靶點。

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