瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響及其機(jī)制

高迪，陳淵錦，劉羽丹，張囡，沙磊

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110122)

瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響及其機(jī)制

高迪，陳淵錦，劉羽丹，張囡，沙磊

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110122)

目的 探討瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響及其機(jī)制。方法 取大鼠十二指腸腸管剪成長(zhǎng)度約1.5 cm的腸段，采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)記錄張力曲線。十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后行以下試驗(yàn)：①依次予3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加濱溶液干預(yù)，每個(gè)濃度作用時(shí)間均為15 min，中間用Kreb′s溶液沖洗20 min。測(cè)量瑞替加濱干預(yù)前及各濃度干預(yù)后十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅。②加入10 μmol/L XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L瑞替加濱作用15 min。計(jì)算瑞替加濱加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。③加入20 μmol/L瑞替加濱作用15 min，再加入10 μmol/L XE-991作用15 min。比較XE-991加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。結(jié)果 ①瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅(基線值)變化百分率為100%。各濃度瑞替加濱作用下張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范圍內(nèi)，隨著瑞替加濱濃度增加提高，平均振幅變化百分率逐漸下降，P均<0.05。②瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。③XE-991加藥后瑞替濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅高于加藥前，P<0.05。結(jié)論 瑞替加濱在6.25～200 μmol/L范圍內(nèi)可呈劑量依賴性抑制大鼠離體十二指腸平滑肌收縮；其機(jī)制可能為激活鉀離子通道。

瑞替加濱；十二指腸；平滑肌；收縮功能；鉀離子通道；體外實(shí)驗(yàn)

瑞替加濱是一種治療成人局限性癲癇發(fā)作的新藥[1]，主要通過(guò)激活電壓依賴性鉀通道(主要為Kv7.2-7.5通道)發(fā)揮作用[2]。瑞替加濱的主要不良反應(yīng)包括尿潴留、神經(jīng)精神癥狀、停藥反應(yīng)、心律失常以及胃腸道不良反應(yīng)，其中胃腸道不良反應(yīng)主要有惡心、便秘、消化不良[3，4]。提示在胃腸系統(tǒng)可能存在對(duì)瑞替加濱敏感的鉀離子通道，瑞替加濱可能通過(guò)這些鉀離子通道影響胃腸道平滑肌收縮，但查閱文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道。2016年10～12月，我們觀察了不同濃度瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響，以及用鉀離子通道阻滯劑XE-991阻斷鉀離子通道后離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級(jí)成年健康SD大鼠16只，體質(zhì)量80～220 g，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。瑞替加濱(純度≥98%)購(gòu)于上海源葉生物有限公司。鉀離子通道阻滯劑XE-991(純度>98%)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。葡萄糖為分析純，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。胃腸動(dòng)力測(cè)量系統(tǒng)由JZ100型張力換能器和BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成。

1.2 離體十二指腸腸管的制備及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接 大鼠實(shí)驗(yàn)前1 天禁食8 h，不禁水。將大鼠放入CO2麻醉箱中麻醉后處死，立即剖開腹腔，取十二指腸，將腸管剪成長(zhǎng)度約1.5 cm的腸段，清除腸系膜及腸道內(nèi)容物后，將腸管置于充滿Kreb′s溶液的恒溫槽中，兩端分別固定于恒溫槽中的固定鉤和張力換能器上，張力換能器連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，由BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)記錄張力曲線。Kreb′s溶液溫度(36±1)℃，并持續(xù)通入含有97%O2、3%CO2混合氣。Kreb′s溶液為使用前現(xiàn)配。配制方法為：稱取7.02 g NaCl、 0.44 g KCl、0.19 g NaH2PO4·2H2O、1.302 g NaHCO3、2.07 g 葡萄糖溶于800 mL雙蒸水中得到溶液1，稱取0.244 g MgCl26H2O、0.278 g CaCl2溶于200 mL雙蒸水中得到溶液2，將溶液1、2混合均勻即得到Kreb′s溶液。

1.3 不同濃度瑞替加濱對(duì)離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，先記錄張力曲線15 min，然后在恒溫槽中依次加入 3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加濱，每個(gè)濃度作用時(shí)間均為15 min，中間用Kreb′s溶液沖洗20 min。測(cè)量瑞替加濱濃度為0(給藥前)、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L時(shí)離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅。各濃度瑞替加濱作用下十二指腸腸管張力曲線平均振幅變化百分率=各濃度瑞替加濱作用下十二指腸腸管張力曲線平均振幅/平均振幅基線值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取均值。

1.4 瑞替加濱對(duì)XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 另取一套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，加入10 μmol/L的XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L的瑞替加濱作用15 min。計(jì)算瑞替加濱加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

1.5 XE-991對(duì)瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 另取一套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，先加入20 μmol/L的瑞替加濱作用15 min，再加入10 μmol/L的XE-991作用15 min。計(jì)算XE-991加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 瑞替加濱對(duì)離體十二指腸腸管平滑肌張力的影響 0 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅(基線值)變化百分率為100%。在3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率分別為(87.4±7.5)%、(70.9±3.9)%、(63.3±9.9)%、(39.0±11.3)%、(30.1±9.3)%、(14.6±2.7)%、(7.1±1.5)%、(8.1±2.8)%。3.125 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率與基線值相比，P>0.05。6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范圍內(nèi)，隨著瑞替加濱濃度提高，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率逐漸下降，P均<0.05。

2.2 瑞替加濱對(duì)XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力的影響 瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率分別為(134.35±13.95)%、(122.28±16.98)%，二者相比P>0.05。

2.3 XE-991對(duì)瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響 XE-991加藥前后瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅分別為(66.11±18.45)%、(86.24±18.80)%，XE-991加藥后瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率高于XE-991加藥前，P均<0.05。

3 討論

研究證明，瑞替加濱參與調(diào)控血管、泌尿生殖系統(tǒng)等組織的平滑肌活性[6～8]。本研究結(jié)果顯示在6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值。在6.25～200 μmol/L范圍內(nèi)，隨著瑞替加濱濃度提高，平均振幅變化百分率逐漸下降，表明瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。證實(shí)在大鼠離體十二指腸平滑肌中存在對(duì)瑞替加濱敏感的鉀離子通道，并且參與調(diào)控十二指腸平滑肌的收縮運(yùn)動(dòng)。

Kv7型鉀離子通道為電壓敏感型鉀離子通道的一種亞型，主要參與調(diào)控細(xì)胞膜去極化，從而影響細(xì)胞活性[9]。XE-991為非選擇性Kv7型鉀離子通道阻斷劑，研究表明， XE-991可增強(qiáng)胃腸道平滑肌、各種血管平滑肌、子宮平滑肌等[10]的收縮強(qiáng)度，其機(jī)制為阻斷細(xì)胞膜上的鉀離子通道，減少鉀離子外流，減小靜息膜電位，使細(xì)胞去極化，增強(qiáng)細(xì)胞興奮性；常作為研究鉀離子通道開放劑或者抑制劑相關(guān)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)的工具藥。本研究采用10 μmol/L XE-991驗(yàn)證瑞替加濱對(duì)大鼠十二指腸的抑制作用，結(jié)果顯示，瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明XE-991阻斷了瑞替加濱對(duì)十二指腸平滑肌收縮的抑制作用。由于XE-991是非選擇性鉀離子通道阻斷劑，故我們認(rèn)為瑞替加濱對(duì)大鼠離體十二指腸腸管平滑肌收縮運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的抑制作用是通過(guò)激活鉀離子通道而實(shí)現(xiàn)的。而調(diào)換給藥順序，先給予瑞替加濱再給予XE-991，離體大鼠十二指腸腸管收縮幅度增加，表明XE-991可以逆轉(zhuǎn)瑞替加濱對(duì)離體大鼠十二指腸平滑肌收縮的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)XE-991和瑞替加濱之間存在競(jìng)爭(zhēng)性拮抗。Kv7型鉀離子通道含有5種亞型，即Kv7.1～7.5,目前已知在小鼠的胃底、胃竇、結(jié)腸、盲腸中各型均有表達(dá)，但表達(dá)量不同，其中Kv7.4、Kv7.5為優(yōu)勢(shì)亞型[10]。而在大鼠胃中只有Kv7.1～7.3通道表達(dá)，且主要分布在胃竇，在胃體分布較少。可見在不同動(dòng)物、不同組織中，Kv7各亞型的分布存在差異，各型在大鼠十二指腸中的分布和表達(dá)量尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究，確定調(diào)控十二指腸收縮運(yùn)動(dòng)的亞型。

綜上所述，瑞替加濱可抑制SD大鼠離體十二指腸收縮功能，其機(jī)制可能與激活鉀離子通道有關(guān)。該結(jié)果提示在十二指腸存在Kv7型鉀離子通道，參與調(diào)節(jié)十二指腸的運(yùn)動(dòng)功能，可能成為十二指腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病的治療靶點(diǎn)。

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Effect of retigabine on contraction of smooth muscle of rat duodenum in vitro

GAODi,CHENYuanjin,LIUYudan,ZHANGNan,SHALei

(SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

ObjectiveTo investigate the effect of retigabine on contraction of the smooth muscle of rat duodenum and to discuss its mechanism.MethodsThe rat duodenum was cut into segments with a length of about 1.5 cm. We used BL-420F Biological Function Experiment System for tension recording. After tension curve was stabilized, we performed the following experiments and each experiment was repeated 6 times. ① We added 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200 μmol/L of retigabine into the solution. The recording time of each concentration was 15 min and each concentration was rinsed with Kreb's solution for 20 min. The mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro was measured before administration and after treatment with different concentrations of retigabine. ② After 10 μmol/L XE-991 was added for 15 min, we added 20 μmol/L retigabine for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after retigabine. ③ After 20 μmol/L retigabine was added for 15 min, we added 10 μmol/L XE-991 for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after XE-991.Results① The percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before retigabine intervention was 100%. The percents of mean amplitude which were treated with retigabine were lower than that of the control group (0 μmol/L),P<0.05. In the range of 6.25-200 μmol/L, the percent of mean amplitude decreased gradually with the increase of retigabine concentration,P<0.05. ② The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by XE-991 did not change significantly before and after retigabine intervention,P>0.05.③ The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by retigabine was higher than that after being given XE-991,P<0.05.ConclusionIn the range of 6.25-200 μmol/L, retigabine can inhibit the contraction of rat duodenal smooth muscle in a dose-dependent manner, and this inhibitory effect may be due to the activation of potassium channel.

retigabine; duodenum; smooth muscle; contraction; potassium channel; in vitro experiment

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270900，81670492)。

高迪(1988-)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要研究方向?yàn)槲改c動(dòng)力學(xué)。E-mail： dgao@cmu.edu.cn。

沙磊(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橐认偕窠?jīng)系統(tǒng)及胃腸動(dòng)力學(xué)。E-mail： lsha@cmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.005

R742.1

A

1002-266X(2017)20-0017-03

2016-12-18)