中晚期胃癌患者外周血T細胞亞群檢測的臨床意義

周蕾 姜妮 王小利 周心娜 司文 任軍

中晚期胃癌患者外周血T細胞亞群檢測的臨床意義

周蕾 姜妮 王小利 周心娜 司文 任軍

目的：研究胃癌患者外周血T淋巴細胞亞群變化的臨床意義。方法：選取2015年10月至2016年5月北京世紀壇醫院腫瘤內科收治的67例胃癌患者，抽取外周血，采用流式細胞術檢測T細胞及其亞群，同時抽取外周血檢測腫瘤標記物CEA、CA199，對結果進行分析比較，并對患者進行隨訪。結果：67例胃癌患者中，Ⅲ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.3±5.1，Ⅳ期患者Tc（CD8+ CD28+）均值為9.9±4.6，兩者比較差異具有統計學意義（P=0.043）；CEA升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3±3.6，而CA199未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.6（P=0.025）。CA199升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3±4.2，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.3（P=0.029），Tc（CD8+CD28+）下降的患者較未下降的患者的總生存時間（overall survival，OS）降低（8.1個月vs.15.1個月，P=0.008）。結論：胃癌患者隨著TNM分期的提高，其機體的細胞免疫功能呈現逐漸下降的趨勢；CEA、CA199升高的患者Tc（CD8+CD28+）降低，二者呈負相關；Tc（CD8+CD28+）降低，患者的OS縮短。

胃癌 淋巴細胞亞群 免疫功能

惡性腫瘤的發生、發展與機體免疫系統功能狀態密切相關，腫瘤患者通常伴有免疫抑制或損害，如果免疫功能持續下降，可促進腫瘤的復發和轉移，降低患者的生存質量和生存率［1-2］。外周血T淋巴細胞亞群檢測是反應腫瘤患者免疫狀態的常用方法，但是其在臨床中的作用以及與預后的關系尚未完全明確。本研究采用流式細胞術（FCM）分析了67例晚期胃癌患者外周血T淋巴細胞亞群不同淋巴細胞的含量，探討其與胃癌常用腫瘤標記物CEA、CA199的關系，以及與患者總生存時間（overall survival，OS）的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取2015年10月至2016年5月北京世紀壇醫院腫瘤內科收治的67例胃癌患者，均經病理活檢確診，影像學證實臨床分期為晚期，無手術適應證。年齡27～89歲，平均年齡（62.0±13.6）歲；臨床分期：Ⅲ～Ⅳ期，Ⅲ期32例、Ⅳ期35例；男性47例、女性20例；腫瘤位置：賁門19例、胃體24例、胃底8例、胃竇14例；分化程度：高分化4例、中分化13例、中低分化8例、低分化35例、未明確7例；轉移情況：肝轉移18例、肺轉移4例、骨轉移38例、腦轉移1例、淋巴結轉移14例。此項臨床研究經北京世紀壇醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 試劑及儀器 流式細胞儀FC500及其配套的數據處理系統均購自美國Beckman-Coulter公司；雅培i-4000全自動化學發光分析儀購自美國雅培公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血T淋巴細胞亞群的檢測 淋巴細胞亞群檢測抽取外周靜脈血4 mL放入EDTA抗凝管，使用直接免疫熒光標記全血溶血法，流式細胞儀測定被檢者外周血淋巴細胞及其亞群。A～F共6管中分別加標有熒光的抗體10 μL、血液樣本50 μL，振蕩。室溫避光放置15 min后加溶血素（BD）400 μL，室溫避光放置8 min后加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS），室溫1 500 r/min離心5 min，棄液、留底部細胞加入PBS液400 μL，震蕩后上機檢測。

1.2.2 外周血CEA、CA199的檢測 CEA、CA199檢測同時抽取外周靜脈血4 mL入惰性分離膠促凝管（內含分離膠和促凝劑），化學發光免疫分析法（che?miluminesent immunoassay，CLIA）進行標本檢測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗，應用Kaplan-Meier法和Log rank檢驗進行OS的分析，并繪制生存曲線。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床分期的胃癌患者T細胞亞群檢測結果

Ⅲ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.3±5.1，Ⅳ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.9±4.6，兩者比較有統計學意義（P=0.043），而Tr（CD4+CD25+）、Ts（CD8+CD28-）、NK、NKT等均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者T淋巴細胞亞群分布Table 1 Lymphocyte subset distribution of stages III and IV gastric cancer patients

2.2 T細胞亞群檢測結果與腫瘤標記物的相關性。

CEA升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3± 3.6，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.6（P=0.025）；CA199升高的患者Tc（CD8+ CD28+）均值為9.3±4.2，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.3（P=0.029），見表2。

2.3 T細胞亞群檢測結果與患者OS的關系。

67例胃癌患者隨訪時間為18個月，無失訪患者，隨訪結果T細胞亞群中，Tc（CD8+CD28+）下降的患者較未下降患者的OS降低（8.1個月vs.15.1個月，P=0.008，圖1）。其它亞群的細胞檢測結果顯示OS差異無統計學意義（表3）。

表2 胃癌患者T淋巴細胞亞群與腫瘤標記物的關系Table 2 Correlation between lymphocyte subsets and tumor markers of gastric cancer patients

圖1 不同狀態的Tc（CD8+CD28+）胃癌患者的生存曲線Figure 1 Progression-free survival curve of gastric cancer patients with different average values of Tc(CD8+CD28+)

表3 胃癌患者不同淋巴細胞亞群與總生存時間的相關性Table 3 Overall survival in gastric cancer patients with different lymphocyte subsets

3 討論

T淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的細胞群，在正常機體內各個T淋巴細胞亞群相互作用，維持著機體正常的免疫功能。T淋巴細胞根據細胞表面標志分為不同功能亞群。抗CD3單抗與CD3抗原分子的ε鏈結合，是總T細胞的標志，而CD4、CD8不能同時表達于成熟的T淋巴細胞表面，故可將成熟的T淋巴細胞分為CD4+T細胞和CD8+T細胞二個亞群。

惡性腫瘤患者通常出現免疫失衡，多表現為細胞免疫功能紊亂，主要表現為T淋巴細胞亞群發生改變，具體表現為CD3+T淋巴細胞、CD3+/CD4+T淋巴細胞以及NK細胞含量改變［3］。有研究結果顯示，胃癌患者外周血CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞的含量以及CD4+/ CD8+淋巴細胞比值明顯低于正常人，CD8+細胞則明顯高于正常人［4］，CD8＋T淋巴細胞與患者的預后相關［4-5］；CD4+CD25+T淋巴細胞升高的乳腺癌患者更容易發生轉移［6］，而化療、放療等臨床治療有可能改變患者T淋巴細胞亞群的狀態［7-8］。

隨著基礎研究的不斷進展，本研究發現CD8+的T細胞依據CD28抗原的不同，又進一步分為CD8+ CD28+和CD8+CD28-兩組不同的T淋巴細胞亞群，而這兩組不同的細胞亞群在細胞免疫過程中分別有著完全不同的功能。CD8+CD28+T淋巴細胞被稱為細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc），是抗腫瘤免疫的主要殺傷細胞；CD8+CD28-T淋巴細胞被稱為調節性的T細胞（suppressor T lymphocyte，Ts），參與調節細胞免疫的過程，這種調節的作用可能是正調節或是負調節。

目前的臨床研究大多只是檢測CD4+和CD8+的淋巴細胞的含量，對于患者免疫狀態的判斷有一定的局限性。本研究用流式分析法將CD4+和CD8+T淋巴細胞根據其不同的細胞表面抗原進一步分為不同的亞群Tc（CD8+CD28+）和Ts（CD8+CD28-），并與腫瘤的臨床分期、腫瘤標志物、預后的相關性進行了分析。本研究將Ⅲ期與Ⅳ期胃癌患者的T淋巴細胞亞群進行分析，CD4+與CD8+的T淋巴細胞兩組比較差異均無統計學意義；將CD8+的T淋巴細胞進一步進行亞群分析，CD8+CD28-T淋巴細胞亞群兩組比較差異均無統計學意義，僅CD8+CD28+兩組比較差異有統計學意義，表明CD8+CD28+與其它的檢測指標相比更能反映患者的免疫狀態；TNM分期不同的患者，Tc（CD8+CD28+）值不同，分期越晚Tc（CD8+ CD28+）越低。Tc（CD8+CD28+）具有識別抗原的特異性，能殺傷具有特定的外來抗原與自身主要組織相容性抗原I（major histocompatibility antigen I，MHcI）結合的復合物的靶細胞，是殺傷腫瘤細胞的特異性淋巴細胞。隨著腫瘤分期的升高，Tc（CD8+CD28+）呈下降趨勢，說明晚期患者抗腫瘤能力即殺傷腫瘤的能力下降。調節細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的腫瘤治療目前已應用于臨床，獲得較好的療效［9-12］。CEA、CA199是胃癌常用的腫瘤標記物，與病情進展有一定的關系，對臨床療效的評價也有一定的參考意義。CEA、CA199持續升高表明患者的腫瘤負荷增加，病情進展，但是CEA、CA199與患者免疫功能變化的關系，特別是重要的抗腫瘤Tc的關系，尚缺乏報道。本研究結果表明CEA、CA199的數值與Tc（CD8+CD28+）的變化，兩者呈負相關，說明隨著患者病情的加重，機體抗腫瘤免疫的功能也是下降的，Tc（CD8+CD28+）的變化也是病情變化的參考指標之一。

本研究還發現Tc（CD8+CD28+）對患者的總生存有重要的作用，Tc（CD8+CD28+）降低的患者OS縮短。CD4+/CD8+細胞比值是反映免疫狀態的主要指標，CD4+/CD8+細胞比值下降預示機體免疫功能降低。本研究的結果表明CD4+/CD8+細胞比值下降組和未下降組在OS上無統計學意義，但是兩組間比較有4.9個月的差值（6.0個月vs.10.9個月），其無統計學意義的原因可能是因為CD4+和CD8+包含了其它功能的亞群細胞，因而Tc（CD8+CD28+）更直接地反映了機體免疫狀態，與預后的關系更明顯。Tr（CD4+ CD25+）又稱為調節性T淋巴細胞（regulatory T lym?phocyte，Treg），目前研究發現Treg可以通過多種機制來抑制免疫效應細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素，并且其增高水平與病程進展和臨床病理存在顯著相關性［12-13］，Treg升高的患者中OS為9.6個月，Treg降低的患者中OS為10.3個月，Treg升高則OS縮短。以Treg及相關免疫抑制性分子作為治療靶點，抑制Treg的功能來開展腫瘤免疫治療可能成為今后腫瘤治療的發展方向。

綜上所述，本研究發現Tc（CD8+CD28+）與胃癌患者的臨床分期與腫瘤標記物升高相關，Tc（CD8+ CD28+）降低則OS縮短，預示患者不良的預后。隨著新的淋巴細胞亞群研究的不斷深入及其臨床意義不斷被發現，淋巴細胞亞群的檢測將成為腫瘤診療的重要參考依據。

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（2016-11-07收稿）

（2017-03-06修回）

（編輯：武斌 校對：楊紅欣）

Detection of lymphocyte immune function in peripheral blood of patients with advanced gastric cancer

Lei ZHOU,Ni JIANG,Xiaoli WANG,Xinna ZHOU,Wen SI,Jun REN

Jun REN;E-mail:jun.ren@duke.edu
Department of Medical Oncology,Capital Medical University Cancer Center,Beijing Shijitan Hospital,Beijing 100038,China

Objective:To investigate the clinical significance of the changes of T lymphocyte subsets in the peripheral blood of patients with gastric cancer.Methods:The lymphocyte subsets in 67 patients with gastric cancer were analyzed with flow cytometry.CEA and CA199 from all patients were also detected.Results were statistically analyzed,and the patients were followed up.Results:The average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with stagesⅢandⅣgastric cancer were 12.3±5.1 and 9.9±4.6,respectively,with significant difference(P=0.043).The average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with elevated CEA and with normal CEA were 9.3±3.6 and 12.1± 5.6,respectively(P=0.025).Similarly,the average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with elevated CA199 and with normal CEA were 9.3±4.2 and 12.1±5.3,respectively(P=0.029).The overall survival of patients with decreased Tc(CD8+CD28+)was lower than that of patients with normal Tc(CD8+CD28+)(8.1vs.15.1 months,P=0.008).Conclusion:The cellular immune function of patients with gastric cancer gradually decreased with the progression of TNM.Higher CA199 and CEA values indicated lower average values of Tc(CD8+ CD28+).The overall survival of patients with decreased Tc(CD8+CD28+)was lower.

gastric cancer,lymphocyte subsets,immune function

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.05.281

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院腫瘤內科（北京市100038）

任軍 jun.ren@duke.edu

周蕾 專業方向為腫瘤分子生物學及靶向治療。

E-mail：zhoulei-057@163.com