基于microcarrier 6構(gòu)建正常免疫小鼠人胃癌移植模型*

畢研貞 孔令斌 高鵬飛 王全義 楊永紅 張小蓓 樊增 王全全 黃炳成 楊峰 張秋生王一波 孫富強(qiáng) Ye Hong 洪豐

基于microcarrier 6構(gòu)建正常免疫小鼠人胃癌移植模型*

畢研貞①孔令斌②高鵬飛③王全義②楊永紅②張小蓓②樊增④王全全①黃炳成⑤楊峰②張秋生②王一波②孫富強(qiáng)②Ye Hong⑥洪豐②

目的：基于新型3D微載體（microcarrier 6）復(fù)合人胃癌MKN45細(xì)胞接種于具有正常免疫功能的小鼠，以期建立新型人胃癌正常小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型。方法：將60只雄性C57BL/6小鼠按是否將MKN45細(xì)胞接種于支架材料隨機(jī)分為2D組、對(duì)照組和3D組；體外構(gòu)建三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型，采用皮下接種法建立小鼠移植瘤模型，觀察小鼠成瘤時(shí)間、成瘤率、病理學(xué)表現(xiàn)等。結(jié)果：2D組和對(duì)照組均未成瘤，3D組成瘤率達(dá)80%，成瘤時(shí)間早，移植瘤HE染色和免疫組織化學(xué)均符合人胃癌特點(diǎn)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功基于microcarrier 6復(fù)合人胃癌MKN45細(xì)胞在正常免疫小鼠中建立人胃癌小鼠移植瘤模型，此模型可以更好地研究和進(jìn)一步闡明胃癌在免疫功能正常機(jī)體中發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，同時(shí)也為抗癌藥物的研發(fā)提供了更有價(jià)值的動(dòng)物模型。

胃癌 microcarrierMKN45細(xì)胞 動(dòng)物模型

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，國(guó)外研究報(bào)道，2013年胃癌居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死亡率第3位［1］。中國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，目前胃癌居中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第2位、死亡率第3位［2］。胃癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全明確，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以模擬胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，是進(jìn)一步探索胃癌生物學(xué)特性和新的治療方案的重要工具。目前人源性胃癌移植動(dòng)物模型多采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠，但免疫缺陷鼠不易飼養(yǎng)，價(jià)格昂貴，更重要的是其無(wú)法反映機(jī)體免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的重要作用。因此探討建立新的人胃癌動(dòng)物移植瘤模型具有重要的意義，本研究將人胃癌細(xì)胞與microcarrier 6共培養(yǎng)后接種于正常免疫小鼠體內(nèi)，以期建立具有正常免疫功能的人胃癌小鼠移植瘤模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠60只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，飼養(yǎng)于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)37009200003571，許可證號(hào)SCXK（魯）20140007］，全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株MKN45購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。維持在含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.1.3 微載體 microcarrier 6由美國(guó)ELYON BIO?TECHNOLOGIES LLC公司提供。由可正電化有機(jī)復(fù)合多聚物組成，呈多層孔狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小、表面正電荷密度、載體顆粒大小可通過(guò)化學(xué)合成調(diào)節(jié)，是純有機(jī)化合物，不易污染，不含雜質(zhì)，具有低免疫原性、生物兼融性及可代謝性等特點(diǎn)，可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的微環(huán)境。

1.1.4 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青鏈霉素均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，兔抗人CA199、CEA、COX-2單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立 將microcar?rier 6浸泡于75%酒精24 h，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3遍，于RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育24 h；用基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascu?lar endothelial growth factor，VEGF）對(duì)微載體進(jìn)行修飾，濃度均為100 ng/mL，孵育時(shí)間為3 h。取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)＞95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL，將MKN45細(xì)胞懸液與修飾好的mi?crocarrier 6混合，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞在microcarrier 6內(nèi)達(dá)到飽和狀態(tài)（鏡下觀察）。

1.2.2 小鼠胃癌移植模型的建立及鑒定 1）動(dòng)物分組：將60只C57BL/6小鼠按照是否將MKN45細(xì)胞接種于支架材料隨機(jī)分為2D組、對(duì)照組和3D組，每組20只。2D組接種含2×106個(gè)/mL MKN45細(xì)胞的1× PBS液100 μL；對(duì)照組接種含50 μg microcarrier 6的1×PBS液100 uL；3D組接種含2×106個(gè)/mL MKN45細(xì)胞和50 μg microcarrier 6的1×PBS液100 uL。2）動(dòng)物模型的構(gòu)建：實(shí)驗(yàn)第1天構(gòu)建三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型，孵育24 h。實(shí)驗(yàn)第2天用1×PBS液清洗孵育好的三維培養(yǎng)體3遍，再用1×PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL，microcarrier 6濃度為500 μg/mL，將所制備的細(xì)胞和microcarrier 6混懸液放在冰上備用；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN45細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用1×PBS液清洗3遍，再用1×PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL，將所制備的細(xì)胞懸液放在冰上備用；將孵育好的microcarrier 6用1×PBS液清洗3遍，再用1×PBS液調(diào)整濃度為500 μg/mL，將所制備的mi?crocarrier 6懸液放在冰上備用；隨后3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組不同進(jìn)行接種，部位為右腋下皮下，100 uL/只。3）觀察指標(biāo)接種之后，小鼠按分組分開(kāi)飼養(yǎng)，每日觀察小鼠的食欲以及活動(dòng)度，并稱(chēng)量小鼠的體質(zhì)量。觀察、記錄小鼠局部腫瘤的發(fā)生時(shí)間、腫瘤的體積。腫瘤長(zhǎng)出后每天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)腫瘤體積公式［3］V=1/2×a×b2，計(jì)算出腫瘤的體積。第3周脫頸處死移植瘤小鼠，完整取出腫瘤組織，記錄腫瘤的質(zhì)量、質(zhì)地、浸潤(rùn)以及壞死程度。腫瘤組織用10%中性福爾馬林固定，以供病理組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色使用。

1.2.3 腫瘤組織免疫組織化學(xué)檢查 腫瘤組織經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫蠟水化，按照免疫組織化學(xué)試劑盒所示的操作步驟進(jìn)行染色、脫水、透明、封片、鏡檢，鏡下觀察染色情況。任意選取5個(gè)陽(yáng)性區(qū)域高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占比率作為評(píng)定依據(jù)，共分4級(jí)，所占比率0～5%為陰性（-），6%～25%為弱陽(yáng)性（+），26%～50%為中等陽(yáng)性（++），＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

2D組和對(duì)照組小鼠食欲和活動(dòng)度無(wú)明顯變化，第10天開(kāi)始，3D組小鼠活動(dòng)稍減少，食欲、毛發(fā)、體質(zhì)量比較無(wú)顯著性差異；2D組、3D組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量比較無(wú)顯著性差異（表1）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)小鼠死亡。

2.2 成瘤時(shí)間、成瘤率與移植瘤性質(zhì)

3D組小鼠在接種后8～10 d即可觸及腫瘤，成瘤率為80%（16/20），腫瘤生長(zhǎng)迅速，體積迅速增大（腫瘤體積只計(jì)算成瘤小鼠數(shù)量）；而對(duì)照組和2D組小鼠均未成瘤（表1）。3D組移植瘤形態(tài)相對(duì)規(guī)整，多為圓形或橢圓形，顏色以灰白色或灰紅色為主（圖1）。

2.3 基于microcarrier 6體外建立MKN45細(xì)胞三維培養(yǎng)體系

2D環(huán)境下觀察MKN45細(xì)胞貼壁，呈不規(guī)則形；microcarrier 6鏡下觀察為不規(guī)則團(tuán)狀或長(zhǎng)梭狀，質(zhì)地疏松；MKN45細(xì)胞與microcarrier 6共培養(yǎng)24 h后可以看到MKN45細(xì)胞較好地貼附在microcarrier 6上，接種也比較均勻，達(dá)到飽和狀態(tài)（圖2）。

2.4 病理學(xué)檢查

2.4.1 HE染色 3D組移植瘤組織在光鏡下可見(jiàn)大量核大深染、大小不一、異形性明顯、雜亂排列的細(xì)胞，并向皮膚、脂肪、肌肉組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)；伴有壞死，位于腫瘤中央；尚未被清除的少許microcarrier 6被包繞形成肉芽腫；瘤組織中新生毛細(xì)血管豐富，多位于腫瘤邊緣（圖3）。

2.4.2 免疫組織化學(xué)染色 CA199、CEA、COX-2主要表達(dá)于癌細(xì)胞膜和胞質(zhì)，結(jié)果顯示CA199、CEA、COX-2均為陽(yáng)性表達(dá)（圖4），進(jìn)一步證實(shí)異型性細(xì)胞為人腫瘤細(xì)胞。

表1 不同時(shí)間小鼠體質(zhì)量、移植瘤體積和成瘤率Table 1 Body weight,tumor volume,and rate of tumor formation of mice at different times

圖1 人胃癌動(dòng)物模型及3D組移植瘤瘤體Figure 1 Human gastric cancer and transplantation tumor models of the 3D group

圖2 MKN45細(xì)胞三維共培養(yǎng)體系 （×100）Figure 2 Three-dimensional coculture system of MKN45 cells(×100)

圖3 人胃癌移植瘤HE染色Figure 3 HE staining of human gastric cancer and transplantation tumor models

圖4 人胃癌移植瘤免疫組織化學(xué)染色 （×200）Figure 4 Immunohistochemical staining of human gastric cancer and transplantation tumor models(×200)

3 討論

胃癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立不僅廣泛應(yīng)用于研究胃癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制，而且在新藥療效及安全性評(píng)價(jià)等越來(lái)越多方面發(fā)揮重要的作用［4-5］。目前常用的胃癌動(dòng)物模型包括：誘導(dǎo)模型、移植模型和基因工程模型［6-8］，其中移植性模型操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用最廣泛。移植模型能否構(gòu)建成功主要取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物類(lèi)型、移植瘤、移植部位和途徑等因素。目前國(guó)內(nèi)外常用免疫功能缺陷的小鼠，如裸鼠、SCID鼠等構(gòu)建移植模型，但免疫功能缺陷鼠存在飼養(yǎng)費(fèi)用昂貴、壽命短、缺乏對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)等不足，故本實(shí)驗(yàn)選取具有正常免疫功能的C57BL/6小鼠。本實(shí)驗(yàn)選取MKN45細(xì)胞構(gòu)建模型，該細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)；移植部位和途徑選擇小鼠腋下皮下異位移植，考慮該部位血供豐富和組織疏松有利于腫瘤的生長(zhǎng)［9-10］。

3D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系作為2D培養(yǎng)體系和動(dòng)物模型之間的橋梁，可以更好地模擬腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，目前已成為研究熱點(diǎn)［11-14］。本實(shí)驗(yàn)所采用microcarrier 6是一類(lèi)新型微載體，MKN45細(xì)胞與之共培養(yǎng)可以成功構(gòu)建三維生長(zhǎng)模型，并且將microcarri?er 6直接包埋到小鼠皮下，血管可以長(zhǎng)入，是目前其它微載體所不具有的特殊優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)用SDF-1α和VEGF對(duì)微載體進(jìn)行修飾，可以加速血管形成，SDF-1α和VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成，為腫瘤的快速生長(zhǎng)提供血供營(yíng)養(yǎng)。國(guó)內(nèi)外已有研究對(duì)免疫功能正常的小鼠進(jìn)行輕度的免疫抑制，使其耐受人腫瘤細(xì)胞，成功制備荷瘤鼠模型［15-16］。但是在不抑制免疫系統(tǒng)的情況下，目前尚缺乏在正常免疫小鼠成功建立人腫瘤異位移植模型的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)即使將MKN45細(xì)胞濃度調(diào)整至2×108/mL，直接100 uL/只皮下接種，小鼠也不會(huì)穩(wěn)定成瘤，其免疫系統(tǒng)對(duì)異種異位移植的人腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)大的免疫清除作用。本實(shí)驗(yàn)所用microcarrier 6具有低免疫源性，質(zhì)地疏松，中間有大量孔隙可供腫瘤細(xì)胞在其中生長(zhǎng)，可短時(shí)間內(nèi)起到屏障作用，阻擋免疫細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并且經(jīng)過(guò)修飾后血管容易長(zhǎng)入，為腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)提供了良好的條件。

借助于本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的MKN45細(xì)胞三維生長(zhǎng)模型，3D組在正常免疫小鼠成功構(gòu)建了人胃癌移植模型，而2D組和對(duì)照組均未成瘤，該模型特點(diǎn)是腫瘤生長(zhǎng)迅速，在8～10 d時(shí)可以觸到腫瘤，11～15 d為腫瘤生長(zhǎng)高峰期，20 d左右腫瘤大小即可達(dá)到0.5 cm3。病理HE染色可見(jiàn)大量核異形性細(xì)胞，并向肌肉、脂肪等浸潤(rùn)；殘存的microcarrier 6被包繞形成肉芽腫；中央有大片壞死，考慮生長(zhǎng)過(guò)快，血供不足所致，符合人體腫瘤發(fā)展規(guī)律；毛細(xì)血管豐富，主要位于腫瘤周邊。免疫組織化學(xué)檢測(cè)CA199、CEA、COX-2均為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)異形性細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功基于microcarrier 6復(fù)合人胃癌MKN45細(xì)胞在正常免疫小鼠中建立了人胃癌小鼠移植瘤模型，雖然技術(shù)操作較裸鼠復(fù)雜，但是可以體現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)和腫瘤的相互作用，在未來(lái)研究腫瘤免疫和新藥研發(fā)等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

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（2016-10-10收稿）

（2017-03-02修回）

Establishment of human gastric cancer model in normal immune mice based on microcarrier 6

Yanzhen BI1,Lingbin KONG2,Pengfei GAO3,Quanyi WANG2,Yonghong YANG2,Xiaobei ZHANG2,Zeng FAN4,Quanquan WANG1,Bingcheng HUANG5,Feng YANG2,Qiusheng ZHANG2,Yibo WANG2,Fuqiang SUN2,Ye HONG6,Feng HONG2

Feng HONG;E-mail:fenghong9508@163.com
1Shandong University School of Medicine,Jinan 250000,China;2Affiliated Hospital of Jining Medical University,Jining 272000,China;3Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics,Dali University,Dali 671000,China;4College of Medicine and Life Science,University of Jinan,Jinan 250000,China;5Shandong Institute of Parasitic Diseases,Jining 272000,China;6University of Turku,Turku 20520,Finland
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81170395,81570556,and 81260676)

Objective:To establish a mouse model of gastric cancer by inoculating MKN45 cells into mice with normal immune function utilizing microcarrier technology.Methods:A total of 60 male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups,namely,2D,control,and 3D groups,according to the coculture system of MKN45 and microcarrier.The mouse models of gastric carcinoma were established by hypodermic injection.The time of tumorigenesis,rate of tumor formation,and pathological features were observed in each group.Results:In the 3D group,the time of tumor formation was short,whereas the rate of tumor formation was high(80%).No detectable tumor formations were observed in the 2D and control groups.HE and immunohistochemical staining of the transplantation tumor model showed evident characteristics of human gastric cancer.Conclusion:A human gastric cancer model in normal immune mice was successfully established.The onset and development mechanism of gastric cancer could be more effectively investigated in mice with normal immune function through this model.Moreover,a more valuable and new animal model for the research and development of anticancer drug was established.

gastric cancer,microcarrier,MKN45 cell,animal model

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.05.168

①山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院（濟(jì)南市250000）；②濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；③大理大學(xué)，云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心；④濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；⑤山東省寄生蟲(chóng)病防治研究所；⑥University of Turku

*本文課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81170395，81570556，81260676）資助

洪豐 fenghong9508@163.com

畢研貞 專(zhuān)業(yè)方向?yàn)橄滥[瘤的精準(zhǔn)治療及腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)。

E-mail：1144084438@qq.com