逆轉錄病毒載體構建過程中的“LTR”和“Ψ”

王麗芬

[摘要]以剖析逆轉錄病毒載體構建的一道試題為起點，分析了逆轉錄病毒基因組中“LTR”和“Ψ”的作用，奠定了逆轉錄病毒載體構建過程中“LTR”和“Ψ”操作要求的理論基礎，這是對試題的必要補充，同時有利于學生對逆轉錄病毒載體構建過程的全面理解。

[關鍵詞]LTR；Ψ；逆轉錄病毒；載體；構建

[中圖分類號]G633.91 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-6058（2017）05-0107-02

南通市2014屆高三第一次調研測試第33題以構建病毒載體并培育轉基因小鼠為情境，主要考查基因工程和胚胎工程的主干知識，又著力考查學生閱讀理解和分析應用的能力，有較好的區分度，充分體現了多維目標考查的價值取向和“源于教材又高于教材”的命題思想，很好地發揮了模擬考試的檢測和學習功能，使學生在學會應用所學知識解決新問題的同時又學到了最前沿的科學知識。

具體試題：逆轉錄病毒載體是目前應用較多的動物基因工程載體之一。運用逆轉錄病毒載體可以將外源基因插入到受體細胞染色體，使外源基因隨染色體DNA一起復制和表達。研究發現，逆轉錄病毒基因組（RNA）的核心部分包括三個基因：gag基因（編碼病毒的核心蛋白）、pol基因（編碼逆轉錄酶）、env基因（編碼病毒的表面糖蛋白）。位于這些基因的兩端有LTR序列（含有啟動子、調節基因等），控制著逆轉錄基因組核心基因的表達及轉移。下圖是構建逆轉錄病毒載體及用于培育轉基因小鼠的過程。回答下列問題：

（1）催化過程①的酶是____。

（2）過程②的工具酶有____和____。過程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的啟動子后，其主要目的是____。

（3）過程③中，導人病毒蛋白編碼基因（gag、pol和env）的目的是____。

（4）過程④中，逆轉錄病毒載體感染的細胞一般選擇內細胞團細胞，因為這類細胞能____。此時，早期胚胎處于____期。

（5）在胚胎移植前，需要對代孕母鼠進行____處理，使其生殖器官（子宮）適于早期胚胎的植入和正常發育。

（6）研究中必須對嵌合小鼠進行篩選，只有能產生____的嵌合小鼠才能將獲得的新性狀遺傳給子代。

參考答案：（1）逆轉錄酶 （2）限制性核酸內切酶（限制酶） DNA連接酶 控制外源基因的表達與轉移 （3）合成組成病毒的蛋白質 （4）發育成新個體的各種組織器官囊胚 （5）同期發情 （6）含外源基因配子

試題分析：由圖中信息可以知道，逆轉錄病毒載體構建的基本原理是用外源基因替換病毒基因組中的三個核心基因，構成一個有缺陷（不能合成包裝蛋白：病毒核心蛋白、逆轉錄酶、表面糖蛋白）的逆轉錄病毒DNA，然后導入能合成病毒包裝蛋白的受體細胞（即包裝細胞），在包裝細胞中包裝蛋白將外源DNA轉錄的RNA包裝成具有感染能力的逆轉錄病毒。但試題所給信息相對有限，學生們對逆轉錄病毒載體構建的理解有一定的障礙。如gag、pol、env這三個基因在包裝細胞里是怎樣啟動表達的？包裝蛋白為何不包裝gag、pol、env轉錄的RNA，而包裝了外源DNA轉錄的RNA？這些問題是學生不理解的，影響著學生對逆轉錄病毒載體構建的全面理解。而要解決這些問題就必須清楚病毒基因組中的“LTR”和“Ψ”的作用及構建逆轉錄病毒載體時的操作要求?！癓TR”、“Ψ”及“gag、pol、env”的位置關系可表示如下：

1.逆轉錄病毒基因組中"LTR"的作用及構建逆轉錄病毒載體過程中的操作要求：LTR是長末端重復序列，分為5'LTR和3'LTR，含有啟動子、調節基因等，其主要作用是啟動和調控基因的表達。在包裝細胞中，包裝蛋白包裝的是RNA，所以導入受體細胞的外源DNA必須能夠轉錄，即要求導入包裝細胞的外源DNA必須帶有LTR。包裝細胞能成功合成包裝蛋白，就需gag、pol、env基因能夠成功表達，所以在構建包裝細胞的時候，導人的gag、pol、env三個基因也必須帶有LTR，否則不能表達，實際操作過程中，導入包裝細胞的是5LTR-gag-pol-env-3'LTR。

2.逆轉錄病毒基因組中“Ψ”的作用及構建逆轉錄病毒載體過程中的操作要求：Ψ序列是包裝信號，包裝蛋白是通過識別RNA中的Ψ序列才對RNA進行包裝的，所以需被包裝蛋白包裝的RNA一定含有Ψ序列，而不需被包裝的RNA一定不能含有Ψ序列。逆轉錄病毒載體中包裝的是外源DNA轉錄的RNA，而非gag、pol、env轉錄的RNA。因此，構建包裝細胞導入gag、pol、env三個基因時，相應的核酸中一定不能含有Ψ序列，而向包裝細胞導入外源基因時，相應的核酸中一定要含有Ψ序列。

綜上所述，構建包裝細胞時，導入的相關基因應是5LTR-gag-pol-env-3LTR，向包裝細胞導入外源基因時，導入的相關基因應是5LTR-Ψ-外源基因-3'LTR。介于以上介紹，可將逆轉錄病毒載體構建過程表示為下圖，更改之后的圖示更有利于學生對逆轉錄病毒載體構建過程的全面理解。

（責任編輯 黃春香）