牛膝醇提物對兔骨關節炎軟骨細胞體外增殖及糖胺聚糖的干預作用

肖偉++++++馬篤軍++++++彭力平++++++王立新++++++余闐++++++廖州偉++++++陳達++++++譚銳泉

[摘要] 目的 觀察牛膝醇提物對兔骨關節炎軟骨細胞體外增殖及對糖胺聚糖（GAG）形成的影響。 方法 骨關節炎造模成功后提取、分離兔骨關節炎軟骨細胞，用甲苯胺藍染色確定軟骨細胞的存在，將軟骨細胞接種于5組：空白對照組、牛膝醇提物低劑量組、牛膝醇提物中劑量組、牛膝醇提物高劑量組、經典軟骨增殖組。倒置相差顯微鏡觀察軟骨細胞形態，用CCK-8法檢測軟骨細胞增殖率，免疫細胞學檢測Ⅱ型膠原蛋白熒光表達，qRT-PCR檢測軟骨細胞標記基因Ⅱ型膠原mRNA表達水平，鄰聯甲苯胺（DMB）染色法檢測細胞內GAG含量。 結果 牛膝醇提物高、中、低劑量組與空白對照組比較Ⅱ型膠原蛋白熒光明顯陽性表達；牛膝醇提物高、中劑量組與空白對照組比較軟骨細胞標記基因Ⅱ型膠原mRNA明顯增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組效果最佳（P < 0.01），與經典軟骨增殖組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；空白對照組GAG含量與經典軟骨增殖組及不同劑量牛膝醇提物組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高劑量組與經典軟骨增殖組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 牛膝醇提物中藥含藥血清可促進體外軟骨細胞的增殖和蛋白合成，具體作用機制有待進一步探討。

[關鍵詞] 牛膝醇提物；軟骨細胞；骨關節炎；增殖；糖胺聚糖

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0020-05

[Abstract] Objective To observe the effects of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae on the proliferation in vitro and glycosaminoglycan （GAG） formation of chondrocytes in rabbits with osteoarthritis. Methods After successful establishment of osteoarthritis model， the chondrocytes in rabbits with osteoarthritis were extracted and separated， the exit of chondrocytes was determined by toluidine blue staining， the chondrocytes were inoculated into five groups： blank control group， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， classic cartilage proliferation group. The cellular morphology of chondrocytes was observed by inverted phase contrast microscope， the proliferation rates of chondrocytes were detected by CCK-8 method， the fluorescent expression of type Ⅱ collagen was detected by immunocytology， the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA was detected by qRT-PCR， the contents of intracellular GAG were detected by DMB staining method. Results Compared with the blank group， fluorescent expression of type Ⅱ collagen in high， median， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were positive； the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA in high， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were significantly increased compared with that of blank control group （P < 0.05）， among which， the effect of high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was the best （P < 0.01）， which had no significant differences compared with that of classic cartilage proliferation group （P > 0.05）； the content of GAG in blank control group had significant differences compared with those of classic cartilage proliferation group and different dosages of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups （P < 0.05）， among which， the content of GAG in high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was at most （P < 0.01）， there was no significant difference between high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group and classic cartilage proliferation group （P > 0.05）. Conclusion Serum containing alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae can promote the proliferation and protein synthesis of chondrocytes in vitro， the specific mechanism needs to be further studied.

[Key words] Alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae； Chondrocyte； Osteoarthritis； Proliferation； Glycosaminoglycan

骨關節炎（osteoarthritis）的核心病理改變是關節軟骨的軟化、破潰和脫落[1]，給社會帶來了巨大經濟負擔，亟待研究解決。軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞成分，是軟骨破壞過程中的靶細胞，因此軟骨細胞的體外培養是研究關節軟骨生理及病理的常用體外實驗模型[2]。通過對古方和專業雜志的統計[3-4]，在治療骨關節炎的中藥中，牛膝的使用頻率最高，筆者前期研究發現[1，5]，牛膝在體內能明顯促進兔骨關節炎和急性軟骨損傷模型軟骨細胞增殖，提高軟骨Ⅱ型膠原表達。故本研究擬在體外研究牛膝醇提物含藥血清共培養干預兔軟骨細胞的增殖及促進糖胺聚糖（glycos？鄄aminoglycan，GAG）的形成作用，現將結果報道如下： 1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM∶F12（1∶1）（HyClone）；倒置相差顯微鏡（Leica）；胎牛血清（FBS，Gibico）；10%甲醛標本固定液（福爾馬林液）；CO2培養箱（Heraeus）；IGF-1（Peprotech）；bFGF（Peprotech）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（Gibco）；CCK-8試劑盒（C0037，碧云天）；TRE-Trizol（Invitrogen）；Primers（上海生工）；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）；BSA（牛血清蛋白，sigma）；Collagen Ⅱ抗體（（ab3092），abcam）；Cy3標記山羊抗小鼠IgG（廣州易錦生物技術有限公司）；DAPI染液（碧云天生物研究所）；抗熒光衰減封片劑（碧云天生物研究所）；倒置熒光顯微鏡（DMI6000B，Leica）；85-2控溫磁力攪拌器（XMTD-701，金壇市醫療器械廠）；牛膝醇提物（懷牛膝，深圳市中醫院藥劑科）等。

1.2 實驗動物

健康新西蘭兔56只，兔齡1～2個月，體重1.0～1.5 kg，雌雄不限，由廣東省醫學動物實驗中心提供[動物合格證號：SCXK（粵）2014-0035]，適應性喂養1周后進行實驗分組，隨機將動物分配至空白對照組（4只）、骨關節炎模型組（52只）。造模6周后從骨關節炎模型組隨機抽取4只實驗兔與空白對照組4只兔進行比較，驗證骨關節炎造模是否成功，再將48只骨關節炎模型組實驗兔分為骨關節炎模型對照組、骨關節炎模型高劑量組、骨關節炎模型中劑量組、骨關節炎模型低劑量組，各12只。實驗地址：深圳市中醫藥研究所，實驗操作符合2006年中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨關節炎動物造模、鑒定 按照馬氏骨關節炎造模方法行實驗兔右膝關節向前伸直位管型石膏固定，石膏外層纏繃帶，肢體不用棉墊包裹，防止石膏易脫落，每天記錄實驗兔肢端血液循環、固定石膏穩定度、活動量等情況，固定6周后行骨關節炎模型鑒定[6]。

1.3.2 牛膝醇提物含藥血清制備 《中國藥典》2010年版牛膝常規高用量12 g，按照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量進行換算，實驗兔每日用量約1 g/kg。按照常規用藥量的1、3、6倍，予骨關節炎模型低劑量組1 g/（kg·d）、骨關節炎模型中劑量組3 g/（kg·d）、骨關節炎模型高劑量組6 g/（kg·d），骨關節炎模型對照組0 g/（kg·d），每天灌胃2次，連續6周，每次灌胃時用蒸餾水配成10 mL。上述實驗動物最后1次灌胃后2 h靜脈采血，經滅活、過濾后分別配成10%含藥血清DMEM∶F12（1∶1）培養液和10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養液作為條件培養液。

1.3.3 軟骨細胞分離、培養 實驗兔麻醉后，無菌切取骨關節炎模型對照組關節軟骨，經沖洗、剪碎、蛋白酶消化后收集離心得到的軟骨細胞團塊后，加入培養液稀釋制成單細胞懸液并行原代培養。細胞爬片后用甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞的存在。待細胞生長密度達70%～80%時消化傳代，以倒置相差顯微鏡觀察體外培養軟骨細胞形態，利用CCK-8法檢測軟骨細胞增殖，酶聯免疫檢測儀在450 nm雙波長處測得相應OD值，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 軟骨細胞體外分組培養、含藥血清干預 取第2代軟骨細胞，在含10%胎牛血清的DMEM∶F12（1∶1）培養液中培養培養1周，換液2次。從第2周起隨機用牛膝醇提物不同劑量組10%含藥血清、10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養液和含胰島素樣生長因子-1（IGF-1）10 ng/mL+堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）10 ng/mL 10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養液，繼續培養2周，每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化并攝片。分別于誘導的第3、6、9、12天進行CCK-8檢測，方法同上。具體分組如下，空白對照組：10%胎牛血清+10%空白血清+DMEM∶F12（1∶1）培養液；牛膝醇提物高劑量組：10%胎牛血清+10%高劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養液；牛膝醇提物中劑量組：10%胎牛血清+10%中劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養液；牛膝醇提物低劑量組：10%胎牛血清+10%低劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養液；經典軟骨增殖組：10%胎牛血清+10%空白血清+IGF-1 10 ng/mL+bFGF 10 ng/mL + DMEM∶F12（1∶1）培養液。

1.3.5 免疫細胞學檢測Ⅱ型膠原蛋白熒光表達 制備空白對照組及實驗組細胞爬片，按照免疫組化試劑盒說明添加抗體，然后顯色，脫水，透明，封片，計算陽性率。

1.4 qRT-PCR引物設計、檢測軟骨Ⅱ型膠原表達

采用Primer 3.0設計Real Time PCR引物，引物序列經NCBI nBlast比對無非特異性擴增，用于qRT-PCR實驗。該實驗目的基因Ⅱ型膠原（ID100009005）引物序列（5' to 3'）：Forward TGTGAACTGGTAGATCTGGT；Reverse AAGAAGTGGAATAAGTGGGCT。分別收集空白對照組與實驗組細胞，將軟骨細胞培養21 d后，提取軟骨細胞總RNA，再用隨機引物，逆轉錄酶轉錄為cDNA，然后以此cDNA第1鏈為模板，進行qRT-PCR擴增。

1.5 GAG含量測定

使用DMB染色法試劑盒檢測細胞內GAG含量，使用24孔培養板培養細胞。首先測定吸光值：細胞裂解液裂解細胞，加入DMB顯色劑，于525 nm波長處比色，測定吸光值；制作標準曲線：硫酸軟骨素作標準溶液，加入DMB顯色劑，測定吸光值，做出標準曲線[7]。兩組曲線相互對比，求出GAG濃度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，對所測定結果進行正態性及方差齊性檢驗，不滿足方差分析時用非參數檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞培養及增殖曲線

原代細胞剛接種時形態主要為梭形或圓形，培養24 h后細胞開始貼壁生長，48 h后基本全部貼壁生長，分布稀疏。培養3～4 d后細胞增殖加快，體型呈多邊形（圖1）。隨著傳代次數增多，細胞增殖活性下降，形態多樣，傳至P5后軟骨細胞出現細胞碎片增多、形態扁平等老化現象，增殖減慢。選擇CCK-8法觀察P1、P3、P5傳代細胞生長曲線，繪制的生長曲線符合Logistic生長曲線規律。傳代第1～2天為生長潛伏期，第3～6天為對數增殖期，對數增殖期結束后進入平臺期和下降期。P1～P3代細胞增殖能力基本相同，P5代細胞生長速度略低于P3。細胞的增殖能力隨傳代次數增加而開始減弱（圖2）。

2.2 免疫細胞學檢測軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白表達

連續培養14 d后，空白對照組（圖3a，封四）輕度Ⅱ型膠原熒光染色，牛膝醇提物高劑量組（圖3b，封四）和經典軟骨增殖組（圖3c，封四）Ⅱ型膠原熒光染色明顯陽性，說明經典軟骨增殖組和牛膝醇提物高劑量組軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原蛋白明顯表達。

2.3 軟骨細胞qRT-PCR結果

qRT-PCR檢測結果分析表明，與空白對照組比較，牛膝醇提物高、中劑量組及經典軟骨增殖組軟骨標記基因Ⅱ型膠原表達量均明顯增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組軟骨細胞標記基因Ⅱ型膠原表達量最多（P < 0.01）。牛膝醇提物低劑量組Ⅱ型膠原表達量與空白對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

2.4 軟骨細胞GAG含量測定

空白對照組GAG含量與經典軟骨增殖組及不同劑量牛膝醇提物組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），其中高劑量組GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高劑量組與經典軟骨增殖組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖5。

3 討論

關節軟骨受組織學和生物學特性的限制，骨組織中未分化的間充質細胞不能進入損傷部位，軟骨破壞后自然修復的組織為纖維軟骨，缺乏原正常透明軟骨的耐用性及力學功能，如何修復病損的關節軟骨是目前骨關節炎研究的重點和難點。

組織工程利用中藥修復組織損傷性疾病的研究逐年增加，一些補肝腎、強筋骨類中藥能夠促進軟骨的形成[8-10]，而牛膝是治療軟骨損傷性疾病如骨關節炎的使用頻率最高的中藥。牛膝有效成分有多糖類、皂苷類、甾酮類、黃酮類等，與其“補肝腎，強筋骨”功效相關的研究有：多糖類具抗氧化、抗細胞凋亡等作用[11]，汪巍[7]研究證實多糖類具有促進軟骨細胞合成GAG的作用，與本研究結果相符合，皂苷類具有促進軟骨增殖的作用，蛻皮甾酮具有促進蛋白質的合成、使受損細胞再生等作用，乙醇提取物能促進軟骨細胞增殖，增加Ⅱ型膠原表達[12]，與本研究體外培養有效促進軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原表達相符合。

多種信號通路參與軟骨細胞生長、成熟過程。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是細胞的能量感受器，可通過感受能量變化（AMP上升，ATP下降）的程度而被激活。研究發現Wnt/β-catenin通路在軟骨細胞成熟、增殖、凋亡等方面起著重要作用，并對軟骨外基質分解代謝亦有著重要的作用，可通過環氧化酶（COX-2）、白細胞介素（IL）、骨形態發生蛋白（BMP2）、基質金屬蛋白酶（MMPs）值變化來影響軟骨代謝。本研究過程中牛膝醇提物組有效促進了軟骨細胞體外增殖，軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫熒光強表達，并且GAG分泌量明顯增多，因此Wnt/β-catenin通路很可能參與其中。陳達等[13]用牛膝醇提物對兔骨關節炎模型灌胃后發現，牛膝醇提物組較空白對照組能明顯降低血液和關節液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β及MMP-3等炎癥介質的含量。因此認為Wnt/β-catenin信號通路是骨關節炎軟骨破壞病程中最重要的信號通路之一，也可能是牛膝醇提物有效促進軟骨細胞增殖和抗凋亡的作用機制之一。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路調節特定的基因表達來參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡等多種細胞的生理過程，是胞外信號引起細胞核反應的共同通路。MAPK被證實在炎癥因子引起軟骨細胞MMPs表達增高的過程中起了重要作用。馬鋼等[14]報道，Caspase-3蛋白在骨關節炎軟骨細胞的凋亡過程中扮演著重要的作用。同樣PI3K/Akt信號途徑的正常表達對軟骨細胞的增殖、分化也具有不可替代的作用[15]。由此可見，軟骨增殖、成熟的過程中，有多條信號通路參與其中，這些信號通路互相交織，在軟骨細胞增殖的進程擔負著不同的作用。

中藥構建軟骨組織工程的研究是一個嶄新的研究領域，許多中藥（包括牛膝）能夠有效地參與成骨活動，并有較高的誘導率、安全性，其中牛膝醇提物屬于單味中藥懷牛膝的濃縮醇提物混合制劑，含有牛膝多種有效成分，具有“組合分化”的特性，比單體藥物制劑作用更加廣泛。研究表明，多糖類具有激活p38MAPK信號通路上調促進骨髓間充質干細胞向成骨分化的作用[16]；皂苷類具有降低Wnt通路β-catenin蛋白的磷酸化來下調β-catenin mRNA的表達和抑制

Wnt信號通路，下調TGF-β1表達發揮抑制系膜細胞增殖[17]；甾酮類可通過激活ERK/MAPK信號通路增加細胞抗氧化作用而發揮促進細胞增殖[18]；黃酮類能調控抑制Wnt通路β-catenin蛋白來改善類風濕性關節炎模型大鼠滑膜組織炎癥狀態[19]，以及通過抑制AMPK通路NF-κB向細胞核轉移，導致細胞核內NF-κB的表達水平降低而抑制炎癥因子IL-6的分泌[20]。因此，進一步研究這種信號通路相互作用的生物網絡機制，明確牛膝醇提物在促進軟骨細胞增殖中，不同分子對其作用的機制，將有助于我們找到治療骨關節炎的靶點，AMPK/Wnt/MAPK信號通路串話可能是牛膝醇提物對骨關節炎軟骨修復作用的信號交互通路之一。

[參考文獻]

[1] 彭力平，馬篤軍，林棟棟，等.牛膝醇提物體內誘導兔骨關節炎模型軟骨修復的病理學觀察[J].湖南中醫雜志，2013，29（2）：126-129.

[2] 李西海，梁文娜，劉獻祥，等.端粒和端粒酶與永生化軟骨細胞[J].國際骨科學雜志，2007，28（6）：351-352.

[3] 郭達，張斌山，劉金文.骨關節炎的古代方藥規律研究[J].南方醫科大學學報，2010，30（9）：2194-2195.

[4] 姚共和，劉向前，李建斌，等.中醫期刊治療膝關節骨關節炎方劑用藥特點分析[J].湖南中醫學院學報，2005，25（6）：54-56.

[5] 彭力平，馬篤軍，裴軍宇.牛膝醇提物對急性軟骨損傷兔軟骨的影響[J].中醫雜志，2013，19（54）：1504-1506.

[6] 曾俊華，馬篤軍，彭力平，等.實驗兔膝骨關節炎模型的建立及鑒定[J].中國臨床研究，2016，29（5）：679-682.

[7] 汪巍.甘草多糖對大鼠骨關節炎軟骨細胞糖胺多糖合成影響及其作用機制的研究[D].武漢：武漢大學，2012.

[8] 史紅逸，趙贊，林琳，等.補腎益氣活血方對人骨關節炎軟骨細胞增殖及相關細胞因子的干預作用[J].河南中醫，2015，35（1）：99-101.

[9] 劉淵，孫雪蓮，周紅海，等.牛膝總皂苷含藥血清對兔膝軟骨細胞增殖與凋亡的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2015，26（10）：2382-2385.

[10] 張君濤，王平，楊光，等.仙靈骨葆膠囊含藥血清對兔軟骨細胞增殖及分泌功能的影響[J].中華中醫藥雜志，2016，31（4）：1479-1482.

[11] Shen Y，Zhang Q，Gao X，et al. An active fraction of Achyranthes bidentata polypeptides prevents apoptosis induced by serum deprivation in SH-SY5Y cells through activation of PI3K/Akt/Gsk3 path-ways [J]. Neurochem Res，2011，36（11）：2186-2194.

[12] 李成付，王玖忠，邊瑜健，等.牛膝醇提物促進兔骨關節炎軟骨修復的作用及其機制的實驗研究[J].中國臨床研究，2015，28（7）：844-877.

[13] 陳達，廖州偉，馬篤軍，等.牛膝醇提物對兔骨關節炎模型的療效比較[J].中國醫藥導報，2016，13（25）：21-24.

[14] 馬鋼，崔珈銜，任明姬.Caspase-3、Caspase-12與骨性關節炎軟骨細胞凋亡的關系[J].中國實用醫藥，2014，9（35）：224-225.

[15] 楊安群，謝獲.當歸-牛膝對兔骨關節炎PI3K/AKT通路的影響[J].放射免疫學雜志，2012，25（5）：526-529.

[16] 李丹青，肖強兵.巴戟天多糖通過p38 MAPK信號通路促間充質干細胞成骨分化的體外研究[J].中國中醫骨傷科雜志，2015，23（5）：1-4.

[17] 孫雪艷，楊麗平，占永立，等.薯蕷皂苷抑制脂多糖刺激的大鼠系膜細胞增殖及對Wnt通路的影響[J].中華中醫藥雜志，2014，29（3）：871-874.

[18] 張可麗，黃秀榕，祁明信，等.蛻皮甾酮和異補骨脂素在HLEC中抗氧化損傷的信號轉導機制[J].國際眼科雜志，2012，12（11）：2072-2074.

[19] 繆成貴，劉健，張永和，等.滁菊總黃酮調控類風濕性關節炎模型大鼠滑膜組織Wnt通路SFRP4表達[J].中南大學學報，2013，38（7）：715-721.

[20] 何標，廉果.槲皮黃酮對AMPK/NF-κB信號通路介導IL-6表達的影響[J].廣東藥學報，2016，32（5）：634-638.