KSHV miRNA在卡波西肉瘤中的研究進展

張 靜，吳秀娟，普雄明*

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

KSHV miRNA在卡波西肉瘤中的研究進展

張 靜1，吳秀娟2，普雄明2*

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

卡波西肉瘤； 卡波西肉瘤相關病毒(KSHV)； KSHV miRNA

miRNA是一類長約23個核苷酸非編碼的小分子RNA[1]。它廣泛存在于多細胞生物中[2]。miRNA通過基因轉錄后與靶mRNA3′UTR互補結合,使靶mRNA降解或抑制蛋白質翻譯[3]。它們參與信號轉導、增殖、凋亡、侵襲或腫瘤血管形成[4，5],在腫瘤學、病毒學、神經生物學、胚胎發育等領域有許多成熟研究[6]。研究表明，miRNA參與了腫瘤相關的許多重要基因的表達。一方面miRNA特異地與抑癌基因轉錄的mRNA結合,抑癌基因功能受到抑制,導致腫瘤發生,miRNA起到促癌基因作用;另一方面miRNA特異地與促癌基因轉錄的mRNA結合,促癌基因功能受到抑制,控制腫瘤發生,miRNA起到抑癌基因的作用。

卡波西肉瘤(KS)是血管瘤樣結構、梭形細胞增生的惡性腫瘤[7],卡波西肉瘤相關病毒(KSHV,即人皰疹病毒8型)由Chang等[8]首先從AIDS相關型KS患者的肉瘤組織中發現。隨后,在各型的KS中均發現了KSHV的高表達。研究發現KSHV是卡波西肉瘤發生的必需因素和主要因素,與KS的發生關系密切。KSHV和大多數DNA病毒同樣也編碼多條miRNA[9],KSHV miRNA可以通過沉默轉錄因子、調控宿主細胞的細胞周期、生存環境等不同途徑感染影響細胞的分化狀態,最終導致KSHV誘導癌變的發生[10]。目前共發現25個KSHV編碼的miRNA,吳秀娟等[11，12]對卡波西肉瘤腫瘤及瘤旁組織行miRNA檢測后,發現13個KSHV編碼的miRNA顯著上調,未見下調的KSHV編碼的miRNA,可見KSHV編碼的miRNA促進了卡波西肉瘤的發生發展。KSHV miRNA很有可能成為卡波西肉瘤治療的分子靶標。但它們的許多功能都未知,需要我們進一步研究探索。

1 KSHV編碼的miRNA

miRNA做為一類特殊的調控分子已受到科學界的廣泛關注。細胞的基因組能編碼細胞的miRNA,一些病毒也能編碼病毒的miRNA。迄今,已經發現至少有8種病毒能編碼miRNA,并在細胞內加工成為成熟的miRNA。為了測定KSHV是否能編碼miRNA,3個研究小組的科學家用經典的“RACE-like”克隆的方法:潛伏感染KSHV或者BC-1或者BCBL-1細胞株進行原位cDNA克隆,建立小RNA文庫,發現代表11種獨特小RNA與KSHV完全配對。隨后,Grundhoff等[13]開發出新策略:計算機預測與微陣列分析相結合用來確認病毒編碼候選miRNA,使用Northern blotting方法驗證。用這種方法驗證了11個之前已知的KSHV pre-miRNA,還發現一個在此之前沒有被檢測到的pre-miRNA,命名新的miRNA為KSHV-miR-K12-12。12條KSHV miRNA均來源于同一條稱作“passenger”的鏈,而且方向相同。因此KSHV編碼12個miRNA前體,通過經典的miRNA生物合成途徑及不同剪接方式共產生25條成熟的miRNA[14],因為它們由12個miRNA前體產生而成,因此命名為miRNA-K12-1到miRNA-K12-12(如kshv-miR-K12-4-3p、kshv-miR-K12-4-5p),簡稱為miRNA-K1到miRNA-K12。Hansen等[11]也在對Kaposics肉瘤功能性改變的研究中發現存在KSHV編碼miRNA。

2 KSHV miRNA的表達及功能

2.1 KSHV miRNA在潛伏期和裂解期的表達

研究發現KSHV編碼的有些miRNA會在病毒潛伏期持續表達,如我們發現miR-K12-11在轉錄后下調天然免疫通路中IKKε的表達,阻斷IKKε介導的IRF3/7磷酸化,部分抑制Ⅰ型干擾素通路的激活用來逃避宿主細胞抗病毒的天然免疫作用,穩定KSHV的潛伏感染,因此miR-K12-11在KSHV潛伏感染期可能發揮重要作用。

進一步的研究證明:KSHV編碼的miRNA都簇集于KSHV基因組的主要潛伏相關區域,此區域編碼潛伏相關性核抗原為LANA、v-cyclin、v-FLIP和Kaposi基因(K12)。兩條miRNA(miR-K12-10,miR-K12-12)位于K12開放讀碼框架內,余10條簇集于v-FLIP與K12之間的非編碼區域。KSHV基因組編碼80多種蛋白質,只有少數在潛伏感染的細胞中表達,如上面所提到的LANA,v-Cyclin,v-Flip和K12。它們具有調節KS細胞宿主內環境作用,并與KSHV miRNA協同表達。

同時在對KSHV裂解復制開關分子RTA的3′UTR報告基因活性實驗發現:miR-K12-7-5P能特異地下調RTA的活性,抑制它的表達。同時顯著抑制RTA下游病毒裂解期基因的轉錄和病毒粒子的釋放,之后在病毒裂解感染期檢測到某些特定miRNA的表達增高,而且其表達水平比潛伏期更高[15]。說明潛伏期和裂解期相關miRNA的表達均在KSHV致病機制中發揮重要作用。呈現出潛伏性和裂解性兩種階段[16],它們之間的轉換則是卡波西肉瘤發生的關鍵步驟[17]。

2.2 KSHV miRNA的功能

目前12種KSHV miRNA的功能大部分未知,Marshall等[18]研究了12種KSHV miRNA的進化保守性:miR-K12-2、-4、-5、-6、-7、-9具有相對明顯的多態性;miR-K12-12完全保守;miR-K12-1、-3、-8、-10、-11高度保守。其中miR-K12-5的多態性影響成熟miRNA的表達水平和生物活性。miRNA-K12-9表現為更大的變異性,這說明miR-K12-9并非是組織培養中生長所必需的。

Marshall等[18]的實驗數據表明:KSHV miRNA基因在體內嚴格選擇,可能參與KSHV相關性惡性腫瘤的生物活性及發病機制,KS肉瘤中,被KSHV感染的腫瘤細胞都為低分化的內皮細胞,內皮細胞根據組織起源分為LECs和血管內皮細胞。Hansen等[19]證明了這些miRNA通過促進病毒介導的細胞重組,在LECs中沉默轉錄因子表達,從而維持分化狀態的LECs,導致KSHV誘導KS的發生。同時Pun等[20]通過對KSHV編碼的病毒FLICE9的研究發現:KHSV的感染以及K13的異位表達抑制了CXCR4的表達,而這種抑制作用與miR-146a的上調表達有關。研究人員[21]對2種位于miR-146a啟動子上的NF-JB位點進行了研究發現:K13可能對這2個位點的激活是必需的。因此通過上調miR-146a,K13誘導的NF-JB活化抑制CXCR4的表達可能通過促進KSHV感染的內皮前體細胞過早釋放到血液循環參與了KS的發展。

3 KSHV miRNA與靶基因

為了驗證KSHV miRNA的靶基因的存在,Samols等[22]在293細胞中擴增表達KSHV miRNA,結果顯示:在miRNA的存在作用下81個基因發生表達變化:表現上調的有8個基因;表達下調的有65個基因。其中明顯下調的有8個基因,變化大于4倍。其中4個基因THBS1、SPP1、PRG1、S100A2分別具有免疫調節、細胞增殖、細胞程序性死亡和血管生成的作用。通過實驗分析,證實3個基因(SPP1、PRG1、THBS1)的變化依賴miRNA調節,其中THBS1下調水平>10倍。值得一提的是,THBS1擁有34個與KSHV miRNA結合的預測位點,理論上12 KSHV miRNA都可以與THBS1結合,這意味著THBS1的抑制對KSHV生物活性非常重要。THBS1被確認是一個抑癌基因,其蛋白質具有抗血管生成作用,是血管發生、遷移、細胞粘連的重要調節因子。THBS1蛋白部分作用可激活TGF-β信號通路途徑,THBS1蛋白水平的降低導致TGF-β活性的降低。KSHV miRNA對THBS1的下調,直接參與KS的發病機制。

KSHV和其他致癌病毒相同,通過阻止細胞凋亡、促進病毒逃逸、篡改信號傳導通路、干擾宿主正常細胞周期等多環節促進腫瘤發生。如miR-K1靶向調節生長抑制信號通路(CDK1)P21的表達,抑制P21介導的細胞周期阻滯[23]。最近有報道某些miRNA能夠直接結合到P21和另一種CDK1(P21)的3′UTR,但在KSHV整個感染過程這些miRNA持續表達所呈現的功能并未闡明[24]。miR-K1在氧應激條件下可下調靶基因BACH1促進細胞生存[25],miR-K1、miR-K3和miR-K4-3p可直接作用于靶基因Caspase3[26],研究還發現miR-K12-11能特異下調靶基因SMAD5的表達[27],抑制TGF-β信號的轉導及其對細胞增殖的抑制作用,從而參與KSHV的促細胞增殖作用。

4 展望

許多動物病毒家族的基因表達產物(蛋白質、smallRNA)被證實可以抑制RNA通路和miRNA增殖,可以設想miRNA、蛋白、基因之間存在三角調節關系,組成復雜的基因表達網絡調控系統。KSHV是KS必不可少的發病因素,尋找KS的發病機制更多應從KSHV入手,鑒于KSHV miRNA和其他病毒miRNA的研究結果可以看出:KSHV miRNA一方面可以調控本身基因,另一方面也可以調控宿主基因。同理,宿主的miRNA也可以調控病毒的基因。所以KS的發病機制有幾種可能路徑:①KSHV miRNA調控的本身抑癌基因,在KS病人中裂解的KSHV表達更多的miRNA促使抑癌基因表達降低,病毒促癌基因表達上調;②不是所有病毒基因都受自身編碼的miRNA控制,那些不受控制的病毒基因可能和宿主的mRNA競爭結合宿主的miRNA,引起宿主mRNA上調表達產物,導致生物效應發生;③宿主的抑癌基因被KSHV miRNA所調控,同以上兩種方式比較,這種調控更有意義、更直接。研究表明:miRNA在細胞程序性凋亡、腫瘤發生中確實起到重要作用,因此KSHV miRNA有可能參與病毒致病形成。我們對大部分的miRNA的功能了解甚少,說明我們探索領域十分廣闊,基于KSHV miRNA在介導病毒-宿主相互作用中的重要作用以及多種miRNA功能研究的不斷清晰,相信在KSHV相關的KS的攻克治療中miRNA很有希望成為新興的治療靶點之一。

[1] 高媛,譚曉華,楊磊.卡波濟肉瘤相關皰疹病毒編碼的microRNAs最新研究進展[J].中國病毒病雜志,2013,3(1):71-74.

[2] 吳秀娟,丁媛,趙宗峰,等.微小RNA-126對卡波西肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響[J].中華實用診斷與治療雜志,2017,31(1):26-28.

[3] 趙洋,張魁,董然.miR-17對靶基因轉化生長因子受體β_2 的負性調控表達[J].中華實用診斷與治療雜志,2015,29(2):129-131.

[4] 張和細.miRNA與動脈粥樣硬化研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志,2015,28(1):1-3.

[5] 陶濤,王祖義,汪國文.肺癌相關microRNA研究進展[J].中華全科醫學,2012,10(2):282-283.

[6] MacFarlane LA, Murphy RP. MicroRNA: biogenesis, function and role in cancer[J]. Curr Genomics,2010,11(7):537-561.

[7] 阮光靖.艾滋病相關卡波西肉瘤的臨床表現和治療以及療效分析[J].當代醫學,2016,22(27):49-50.

[8] Chang Y,Cesarman E, Pessin MS,etal.Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma[J].Science,1994,266(5192):18.

[9] Grundhoff A, Sullivan CS. Virus-encoded microRNAs[J]. Virology,2011,411(2):325-343.

[10] Hansen A, Henderson S, Lagos D,etal. KSHV-encoded miRNAs target MAF to induce endothelial cell reprogramming[J]. Genes Dev,2010,24(2):195-205.

[11] 吳秀娟,普雄明.MicroRNAs在卡波西肉瘤發病機制中的研究進展[J].國際病毒學雜志,2013,20(6):281-284.

[12] Wu XJ, Pu XM, Zhao ZF,etal. The expression profiles of microRNAs in Kaposi’s sarcoma[J]. Tumor Biol,2015,36(1):437-446.

[13] Grundhoff A, Sullivan CS, Ganem D. A combined computational and microarray-based approach identifies novel microRNAs encoded by human gamma-herpesviruses[J]. RNA,2006,12(5):733-750.

[14] Umbach JL, Strelow LI, Wong SW,etal. Analysis of rhesus rhadinovirus microRNAs expressed in virus-induced tumors from infected rhesus macaques[J]. J Virol,2010,405(2):592-599.

[15] Lin YT, Kincaid RP, Arasappan D,etal. Small RNA profiling reveals antisense transcription throughout the KSHV genome and novel small RNAs[J]. RNA,2010,16(8):1540-1558.

[16] Ye F, Lei X, Gao SJ. Mechanisms of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latency and reactivation[J]. Adv Virol,2011,2011:193860.

[17] Gantt S, Casper C. Human herpesvirus 8-associated neoplasms: the roles of viral replication and antiviral treatment[J]. Curr Opin Infect Dis,2011,24(4):295-301.

[18] Marshall V, Parks T, Bagni R,etal. Conservation of virally encoded microRNAs in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus in primary effusion lymphoma cell lines and in patients with Kaposi sarcoma or multicentric Castleman disease[J]. J Infect Dis, 2007,195(5):645-659.

[19] Hansen A, Henderson S, Lagos D,etal. KSHV-encoded miRNAs target MAF to induce endothelial cell reprogramming[J]. Genes Dev,2010,24(2):195-205.

[20] Pun J,Matta H, Schamus S,etal. Kaposics sarcoma-associated herpesvirus encoded viral FLICE inhibitory protein(vFILP)K13 suppresses CXCR4 expression by unregulating miR-146a [J]. Oncogene, 2010,29(12):1835-1844.

[21] 王子杰,盧春.miRNAs在KSHV致病機制中作用的研究進展[J].醫學綜述,2011,2(17):201-204.

[22] Samols MA,Skalsky RL,Maldonado AM,etal.Identification of cellular genes targeted by KSHV-encoded microRNAS[J].PLoS One,2007,3(65):611-618.

[23] Gottwein E, Cullen BR. A human herpesvirus microRNA inhibits p21 expression and attenuates p21-mediated cell cycle arrest[J]. J Virol,2010,84(10):5229-5237.

[24] Gottwein E, Corcoran DL, Mukherjee N,etal. Viral microRNA targetome of KSHV-infected primary effusion lymphoma cell lines[J]. Cell Host Microbe,2011,10(5):515-526.

[25] Qin Z, Freitas E, Sullivan R,etal. Upregulation of xCT by KSHV-encoded microRNAs facilitates KSHV dissemination and persistence in an environment of oxidative stress[J]. PLoS Pathog,2010,6(1):e1000742.

[26] Suffert G, Malterer G, Hausser J,etal. Kaposi's sarcoma herpesvirus microRNAs target caspase 3 and regulate apoptosis[J]. PLoS Pathog,2011,7(12):e1002405.

[27] Liu Y, Sun R, Lin X,etal. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-encoded microRNA miR-K12-11 attenuates transforming growth factor beta signaling through suppression of SMAD5[J]. J Virol,2012,86(3):1372-1381.

國家自然科學基金面上項目(81660454)

張靜,女,1979-12生,在讀博士,主治醫師,E-mail:565992809@qq.com

2017-03-27

R730.269

A

1007-6611(2017)07-0743-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.024