瑞士乳桿菌的益生功能及應用研究進展

徐 煜,劉振民,游春蘋

(乳業生物技術國家重點實驗室,上海乳業生物工程技術研究中心, 光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海200436)

瑞士乳桿菌的益生功能及應用研究進展

徐 煜,劉振民,游春蘋*

(乳業生物技術國家重點實驗室,上海乳業生物工程技術研究中心, 光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海200436)

瑞士乳桿菌具有強大的蛋白水解能力和諸多的益生活性,是當前益生菌研究的熱點。本文對瑞士乳桿菌發酵牛乳產生的水解肽的益生活性及相關的蛋白水解系統,瑞士乳桿菌產生的胞外多糖益生活性和瑞士乳桿菌自身的益生活性進行了綜述,并總結了瑞士乳桿菌在奶酪發酵中研究進展和新型應用的探索研究。諸多的研究表明,瑞士乳桿菌是一種具有廣闊應用前景的益生菌。

瑞士乳桿菌,水解肽,益生功能,胞外多糖,應用

乳酸菌(lactic acid bacterium)是乳品工業中廣泛應用的一類重要的益生菌,能調節人體腸道功能,提高免疫能力。乳酸菌主要包括雙歧桿菌和乳桿菌,瑞士乳桿菌是乳酸菌中營養缺陷最高的菌種之一,具有強大的蛋白水解能力,其蛋白水解產物具有抗高血壓,消炎和抗癌等功能[1]。同時瑞士乳桿菌也是一種安全的益生菌,能調節宿主菌群抑制致病菌。另外,瑞士乳桿菌能適應多種環境,包括高溫、低pH、低滲透壓、低氧,從而比其他雙歧桿菌和乳桿菌更適合制成益生菌制劑[2]。瑞士乳桿菌的諸多功能特性,具有廣泛的應用前景,引起了眾多研究者的關注。

已有的綜述對瑞士乳桿菌的益生功能[2],蛋白水解系統[3]和細胞壁蛋白[1]進行了討論,豐富了人們對瑞士乳桿菌益生功能的種類,益生功能產生機制的了解。然而相對于其他乳酸菌的研究,對瑞士乳桿菌的報道仍然相對較少,瑞士乳桿菌的益生功能,益生物質和機制等方面仍有待深入研究。本文在已有綜述的基礎上,結合近5年來瑞士乳桿菌新報道,從瑞士乳桿菌的益生活性產生來源的角度,分三方面綜述了瑞士乳桿菌的益生活性,包括來自水解肽的益生活性,來自胞外多糖的益生活性,及菌株自身的益生活性。最后,本文討論了瑞士乳桿菌的應用研究和新型研究的探索。

1 瑞士乳桿菌水解肽的益生功能及蛋白水解系統

基因序列分析表明,瑞士乳桿菌自身缺乏16種氨基酸的合成,是營養高度缺陷菌[2]。由于瑞士乳桿菌的高度營養缺陷,其自身有一套復雜的蛋白水解系統。在牛乳的發酵過程中,這套蛋白水解系統將牛乳中的酪蛋白水解為多肽,并進一步降解為氨基酸供自身生長利用。和牛乳中的嗜冷菌蛋白水解能力不同,嗜冷菌將牛乳酪蛋白水解形成多肽時,往往形成苦味肽導致牛乳變苦和異味[4]。而瑞士乳桿菌恰恰相反,瑞士乳桿菌往往用于干酪發酵中以降低奶酪的苦味并增加獨特風味[5]。不僅如此,瑞士乳桿菌水解牛奶蛋白形成的多肽往往具有獨特的益生功能,包括抗高血壓和免疫調節能力,從而引起人們的關注[2]。

1.1 水解肽的抗高血壓功能

高血壓是全球性的重大健康問題,三分之一的西方人和百分之四十的45歲以上的中國人的健康受高血壓的影響[6]。高血壓病是一種危及生命的慢性疾病,血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)能促使血壓升高,是控制高血壓的有效靶點[6]。

在1996年,Takano的研究發現,瑞士乳桿菌發酵乳有抗高血壓活性。進一步的研究表明,瑞士乳桿菌水解牛乳產生的多肽異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Ile-Pro-Pro,IPP)和異纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Val-Pro-Pro,VPP)具有抑制血管緊張素轉化酶(ACE-Inhibitory,ACE-I)活性[7]。目前為止,這兩種多肽是研究的最廣泛的抗高血壓多肽,并被證明在人體和大鼠體內都有功效[6]。

研究發現,不同瑞士乳桿菌菌株發酵乳的ACE-I活性是不同的。在眾多不同的瑞士乳桿菌菌株中,大部分的菌株發酵乳都有不同程度的ACE-I活性,例如Yongfu Chen等人從中國和蒙古傳統發酵食品中分離出259株瑞士乳桿菌,對其發酵特性的研究結果表明:37株有超過50%的ACE-I的抑制活性,其中菌株H9發酵的酸奶表現出最高的ACE-I抑制活性(86.4%±1.5%),相對短的發酵時間(7.5 h)以及可以檢測的多肽濃度:VPP(2.409±0.229) μmol/L和IPP(1.612±0.114) μmol/L[6]。

瑞士乳桿菌發酵乳的抗高血壓活性不僅和菌株有關,而且和發酵培養基、發酵時間等條件也密切相關。研究表明,瑞士乳桿菌只有在牛奶發酵中,才會產生抗血管緊張素三肽VPP和IPP,而在豆奶和馬奶發酵乳中不產生[8]。在牛乳發酵中,和乳清蛋白濃縮物發酵相比,用脫脂乳培養能支持菌株更好生長并產生更高的蛋白水解活性和體外ACE-I抑制活性[9]。而如果在牛乳中添加蛋白胨或者添加氨基酸,如甘氨酸(Gly),異亮氨酸(Ile),亮氨酸(Leu),苯丙氨酸(Phe),甲硫氨酸(Met),絲氨酸(Ser)和 纈氨酸(Val),則會對發酵奶中的VPP和IPP的產量有明顯的抑制[10-12]。通過DNA芯片分析,發現最有可能參與VPP和IPP產生的基因都有下調,這些結果表明,在牛奶發酵中從牛奶多肽中釋放的氨基酸可能下調一些蛋白水解系統的基因表達,進而導致瑞士乳桿菌發酵奶中VPP和IPP釋放的抑制[10]。

1.2 水解肽的免疫調節功能

瑞士乳桿菌發酵乳具有消炎和抗細菌感染等免疫調節功能,一般而言,這些免疫調節功能被認為是來自菌株自身[2]。但是也有研究發現,瑞士乳桿菌發酵奶的無細胞組分也能對宿主進行免疫調節。瑞士乳桿菌發酵乳能上調IL-6,進而使細胞受保護,抵抗沙門氏菌(Salmonellainfection)的侵害,進一步的研究表明,來自α-乳白蛋白和β-乳清蛋白的肽餾分起主要保護作用,這些肽餾分沒有毒性,其保護作用是計量依賴的,其機理可能是刺激機體免疫調控,產生促炎因子TNF-α[13]。瑞士乳桿菌發酵乳中水解肽的免疫調節研究還相對較少。

1.3 蛋白水解系統

瑞士乳桿菌有一套復雜的蛋白水解系統,包括3類:細胞壁蛋白(CEP),細胞膜上轉運系統,胞內蛋白[1]。在瑞士乳桿菌發酵過程中,細胞壁蛋白負責將牛乳中蛋白降解為寡肽,寡肽通過細胞膜上的轉運系統運送進細胞內,細胞內的胞內蛋白負責將寡肽進一步水解為游離氨基酸。乳酸菌發酵乳中的寡肽一般認為是由CEP催化生成,不同乳酸菌一般有其獨特的CEP蛋白,通常CEP蛋白有四類：PrtP,PrtR,PrtS和PrtH,瑞士乳桿菌的CEP屬于PrtH蛋白。

瑞士乳桿菌發酵乳中的活性肽是由PrtH蛋白水解αS1-和β-酪蛋白產生[14]。瑞士乳桿菌PrtH主要是水解β-酪蛋白的N端,并優先降解β-酪蛋白的疏水性殘基和谷氨酰胺類殘基[15]。也有報道發現,瑞士乳桿菌SBT11087 CEP主要降解β-酪蛋白碳端[16]。雖然瑞士乳桿CEP蛋白的研究相對透徹,但是CEP蛋白的基因以及不同CEP蛋白在不同乳酸菌種的分布是需要進一步研究的。

瑞士乳桿菌中,寡肽運輸系統涉及的酶:PepE和PepO2,很可能和血管緊張素抑制多肽的產生有關[12],最近報道了一個對支鏈氨基酸響應的調控因子BCARR,對瑞士乳桿菌蛋白水解系統起負調控作用[17]。然而,在瑞士乳桿菌中,和活性肽產生相關的細胞膜寡肽運輸系統,胞內蛋白和蛋白水解系統的調控因子的研究相對較少。

2 瑞士乳桿菌胞外多糖(EPS)的益生功能

益生菌產生的胞外多糖是一類重要的益生元,EPS中含有支鏈的,重復的糖或糖衍生物的單位,如半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖等。細菌的胞外多糖作為組織成型劑、增粘劑、穩定劑，乳化劑和抗縮水劑，廣泛應用于食品行業中[18]。此外,微生物的胞外聚合物已可在醫藥和制藥工業替代免疫調節,抗炎,抗生物膜和抗氧化的藥物。瑞士乳桿菌的胞外多糖也不例外。

Dong等人對瑞士乳桿菌MB2-1分泌的胞外多糖進行了系統的研究,研究表明,瑞士乳桿菌MB2-1分泌的胞外多糖對三種食源性致病菌抗生物膜形成能力[18]。他們對瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖粗提物和純化的多糖研究表明,其胞外多糖對自由基表現出強的清除活性,以及對亞鐵離子的螯合活性。他們的抗氧化活性遞減的順序是粗提物>EPS-3>EPS-2>EPS-1[19]。MB2-1胞外多糖LHEPS-1 具有抑制人體結腸癌細胞Caco-2 的增殖的功能[20],胞外多糖LHEPS-2對人體胃癌細胞BGC-823表現出很高的體外抑制活性。并解析了活性最高的LHEPS-2的結構[21]。

另一種瑞士乳桿菌Rosyjski的胞外多糖也具有免疫調節活性[22]。其結構是一個雜多糖,含有D-葡萄糖,D-半乳糖和N-乙酰-D-甘露糖苷的五糖重復單元分支。這個多糖和HT29-19A腸上皮細胞接觸后能刺激上皮細胞顯著提升促炎因子IL-8的水平。此外,它還能調節Toll類受體的mRNA表達,使得細胞在隨后接觸細菌抗原時更加敏感。這個結果表明胞外多糖能在通過與腸上皮細胞的特異性作用對腸道穩定發揮潛在的作用。其他瑞士乳桿菌產生的多糖報道相當有限,瑞士乳桿菌的胞外多糖值得進一步研究。

3 瑞士乳桿菌菌體自身的益生功能

3.1 免疫調節功能

瑞士乳桿菌在牛乳發酵過程中產生水解肽以及EPS，具有免疫調節活性,研究表明,菌株自身也表現出了免疫調節作用,包括提高T細胞表達,降低小鼠促炎因子的產生等。

瑞士乳桿菌LH2171能夠阻抑免疫細胞的增殖和促炎細胞因子(IL-6和IL-1β)的產生,而阻抑的行為并不是來自于對免疫細胞的毒性[23]。瑞士乳桿菌NS8對人體腸道上皮細胞有良好的結合能力,對小鼠結腸炎有相當的預防作用,促使其抗炎細胞因子IL-10分泌水平的提升[24]。使用適當的益生菌保護咽粘膜，是預防上呼吸道和尿道感染的策略。MIMLh5和 ST3菌株的新型產品能對咽粘膜有益生作用，并能預防上呼吸道和尿道感染,瑞士乳桿菌MIMLh5能有效粘附于咽上皮細胞,對抗化膿鏈球菌,以及通過顯著誘導炎性腫瘤細胞壞死因子α(TNF-α)的表達,從而激活U937巨噬細胞,進而調節宿主的先天免疫[25]。瑞士乳桿菌HY7801可以通過抑制NF-κB細胞通路和阻抑白色念珠菌的生長改善外陰陰道念珠菌病。用瑞士乳桿菌HY7801(LH)進行口服或陰道治療的小鼠,其陰道內活性白色念珠菌水平和陰道組織內量化的髓過氧化物酶活性明顯降低，有效抑制外陰陰道念珠菌病[26]。同時研究表明瑞士乳桿菌能減輕嬰兒牛奶過敏患者對牛奶的過敏反應,乳桿菌蛋白酶對αS1-和β-酪蛋白的水解降低了人體免疫球蛋白IgE的特異性識別[14]。

雖然益生菌對宿主的健康有益,但是他們的有效性是菌株特異的。發展有效的篩選模型,是研究的熱點。為篩選抗炎益生菌,近期Kim等人發展了一套體外篩查系統,并通過實驗性關節炎作為體內模型,以IL-10上調和IL-12下調作為篩選標準,建立了益生菌篩選方法[27]。結果證實,口服篩選得到的瑞士乳桿菌HY7801能預防膠原誘導的實驗性關節炎,并通過降低特異性抗原IgG的水平以及免疫反應,減輕疾病的發展和嚴重程度。

乳酸菌菌株的益生功能和其細胞外被膜上的S-層蛋白(Surface Layer Protein)密切相關。S-層蛋白是細胞外被膜蛋白的粘附位點,賦予細胞疏水特性,以及和腸上皮及其他細胞特異的作用能力,其關系到細菌的益生通路形成[28]。S-層蛋白已經在幾株瑞士乳桿菌中證實,他們組成了細胞外包被的最外層結構,他們是一組僅僅由非共價鍵結合的蛋白。S-層蛋白的功能除了和腸道粘附,還有保護細胞對抗腸道消化酸和酶的作用,決定細胞形狀,分子和離子捕獲附。研究表明,瑞士乳桿菌的S-層蛋白的氨基酸組成,二級結構和生理特性和來自其他乳酸菌的S-層蛋白非常相似[29]。和S-層蛋白合成相關的基因slpH,雖有一定保守性,但不能作為看家基因。通過檢測S-層蛋白進而篩選具有免疫活性的瑞士乳桿菌,是一種有效的篩選方法。Milda發展了免疫活性的單鏈可變片段scFvs克隆抗體,這個抗體能特異結合瑞士乳桿菌的S-層蛋白,具有檢測乳制品中瑞士乳桿菌S-層蛋白的能力[30]。

3.2 對宿主行為的調節

腸道菌群能通過腸腦軸對宿主的行為產生影響,研究表明,瑞士乳桿菌也具有精神類調節功能。瑞士乳桿菌R0052和雙歧桿菌R0175的益生菌制劑能緩解大鼠的焦慮和人類志愿者的心理壓力[31]。進一步的研究表明,宿主的飲食類型,是否有炎癥可能明顯改變瑞士乳桿菌對大鼠焦慮行為的調節[32]。瑞士乳桿菌對宿主行為的調節仍有待進一步研究。

4 瑞士乳桿菌的應用

4.1 瑞士乳桿菌的傳統應用

瑞士乳桿菌是瑞士干酪和意大利干酪生產中的傳統用菌[33],瑞士乳桿菌在奶酪發酵中,通常被認為具有降低奶酪苦味并加速風味形成的能力,也能在牛奶中釋放生物活性肽[34],同時代謝掉殘余的碳水化合物以抑制產氣微生物的生長[35]。在奶酪成熟過程中,瑞士乳桿菌降解酪蛋白形成的低水解度酪蛋白以及一類特殊疏水性多肽,這些多肽和奶酪的拉絲性能密切相關[36]。

奶酪的風味形成和奶酪成熟過程中瑞士乳桿菌自降解釋放胞內肽酶密切相關。瑞士乳桿菌的自降解與瑞士乳桿菌細胞壁多糖結構和肽聚糖水解酶(Peptidoglycan hydrolases,PGHs)相關[37]。肽聚糖水解酶(Peptidoglycan hydrolases，PGHs)是一種細胞酶能水解細胞壁的肽聚糖導致自溶。有九個編碼PGHS的基因已經在高降解瑞士乳桿菌菌株DPC4571中被注釋[37]。這些基因在瑞士乳桿菌中分布性的不同,對奶酪風味有重要影響。檢測瑞士乳桿菌蛋白酶或肽酶基因,以及肽聚糖水解酶是開發新型風味奶酪發酵菌的重要方法。

4.2 瑞士乳桿菌應用新探索

4.2.1 發酵中的新應用 隨著瑞士乳桿菌關注度的提高,牛乳發酵之外的新型應用也有諸多報道。除了用于牛乳發酵,瑞士乳桿菌還被嘗試用于黑面包的發酵過程[38],和酵母混合用于谷物發酵以制作飲料[39],以及綠豆乳發酵[40]。

研究發現,瑞士乳桿菌具有抗真菌活性,來源自有機酸和菌株KLDS 1.8701自身[41]。此菌在豆奶發酵和儲藏過程中,能抑制Penicilliumsp.及其他來自環境的腐敗微生物并能延長產品的貨架期。在發酵豆奶中添加KLDS 1.8701對產品的生化性質,流變性質和口感都沒有明顯影響。他能增強乳酸菌(瑞士乳桿菌和保加利亞乳桿菌)的活菌數,并不影響嗜熱鏈球菌。因此,在其他發酵產品中,瑞士乳桿菌 KLDS 1.8701也可以被用做生物保護基。

4.2.2 其他新應用 由于其安全性,瑞士乳桿菌的應用研究不只局限于食品中。在瑞士乳桿菌的其他代謝產物的應用方面,Sharma等人報道了瑞士乳桿菌產生一種主要由脂肪酸和糖片段組成生物表面活性劑,能將pH7.2的磷酸鹽緩沖液的表面張力從72.0降低至39.5 mN·m-1。這種乳酸菌生物產生無毒表面活性劑在新興的生物醫學領域有相當的應用前景[42]。在瑞士乳桿菌菌體應用方面,陳剛等人發現,在大菱鲆幼魚養殖中使用瑞士乳桿菌和其他有益微生物的組合,能有效地提高大菱鲆幼魚的成活率，改善養殖環境[43]。

由于其強大的蛋白水解能力,瑞士乳桿菌還被應用于工業的生產中,以降低生產成本和環境污染。例如,Arbia等人嘗試用篩選瑞士乳桿菌降解蛋白提取角素,以取代工業生產中強酸、強堿和高溫的極端條件。經過條件優化,可以達到98%的脫礦率和78%的蛋白降解率,具有良好的應用前景[44]。

5 結論

瑞士乳桿菌水解酪蛋白產生抗高血壓多肽,是其獨特的發酵特點,發酵過程中調控抗高血壓多肽的產生是研究的熱點。除了篩選特定瑞士乳桿菌的菌株和優化發酵條件之外,對瑞士乳桿菌蛋白水解系統中涉及抗高血壓肽產生的蛋白酶和調控因子的研究,是進一步提高抗高血壓多肽的產量的基礎研究方向。瑞士乳桿菌自身及發酵產物除了抗高血壓之外,還有調節免疫(抑菌,消炎和抗癌)和調節宿主行為的活性。這些益生活性都有待繼續深入研究。

奶酪是西方重要的奶制品,瑞士乳桿菌在奶酪成熟過程中扮演重要作用。瑞士乳桿菌能降低奶酪苦味,增強拉絲性能和產生獨特風味,研究與這些功能相關的蛋白酶,肽酶和尋找與之相關的基因是重要的研究課題。

雖然瑞士乳桿菌益生功能已被廣泛報道,但是其產生的活性物質以及新型應用還有待人們進一步認識和開發。綜上所述,瑞士乳桿菌是一種具有廣闊發展前景的益生菌。

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Research progress on the probiotic function and application ofLactobacillushelveticus

XU Yu,LIU Zhen-min,YOU Chun-ping*

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology, Research Center of Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

With a strong ability of protein hydrolysis and many probiotic functions,Lactobacillushelveticushas become a hot spot in research of probiotic bacteria. In this paper,probiotic activities of hydrolyzed peptides originated inL.helveticusfermented milk and the related proteolytic system ofL.helveticus,probiotic activities of extracellular polysaccharides produced byL.helveticusand probiotic activities ofL.helveticusstrains were reviewed. At last,the research progress and new applications ofL.helveticusin cheese fermentation were also summarized. Many studies have indicated thatLactobacillusis a kind of probiotics with broad application prospects.

Lactobacillushelveticus;hydrolyzed peptide;probiotic function;extracellular polysaccharide;application

2016-09-22

徐煜(1986-),男,博士,研究方向:乳品安全,E-mail:xuyuhuaxuexi03@126.com。

*通訊作者:游春蘋(1981-),女,博士,高級工程師,研究方向:乳品安全,E-mail:youchunping@brightdairy.com。

國家“十二五”科技支撐計劃(2013BAD18B01);上海市科委項目(16DZ2280600);上海市閔行區領軍人才項目(201443)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)08-0374-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.064