基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸變異的初步探討

朱永豹

基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸變異的初步探討

朱永豹

目的 初步探討戊型肝炎病毒（HEV）ORF3蛋白氨基酸變異情況，為其功能研究提供相關(guān)線索。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增41株基因4型HEV RNA ORF3基因片段，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，然后采用DNAstar軟件將測(cè)序結(jié)果翻譯成氨基酸序列，初步探討其變異情況及與基因1型HEV ORF3蛋白差異。結(jié)果 19株HEV RNA ORF3擴(kuò)增陽(yáng)性，其長(zhǎng)度均為345bp，編碼蛋白含有114個(gè)氨基酸，共19個(gè)位點(diǎn)突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無(wú)突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，P2區(qū)兩個(gè)PXXP基序無(wú)突變。結(jié)論 與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)氨基酸均存在突變，這些變異是否影響我國(guó)基因4型HEV ORF3蛋白結(jié)構(gòu)和功能仍需進(jìn)一步研究；但P2區(qū)兩個(gè)PXXP基序高度保守，推測(cè)其可能在不同型HEV致病過(guò)程中起著重要的作用。

戊型肝炎病毒 ORF3蛋白 氨基酸變異

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）主要流行于衛(wèi)生條件低下的亞非國(guó)家，發(fā)達(dá)國(guó)家也有散發(fā)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，是一個(gè)重要的全球問(wèn)題，其病原體戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是一種無(wú)包膜、單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7.2kb，包括三個(gè)開(kāi)放讀碼框（open reading frames，ORFs），其中ORF1蛋白和ORF2蛋白的功能研究比較透徹，而ORF3蛋白功能尚不清楚，近年來(lái)研究顯示HEV可能與促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制機(jī)體免疫反應(yīng)和病毒感染及顆粒裝配、釋放等有關(guān)，這些功能一般是通過(guò)ORF3蛋白含有的某些特異氨基酸區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的［1-7］，一旦上述區(qū)域的氨基酸發(fā)生突變，ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能是否改變不得而知，本研究主要探討基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸變異情況，為其功能研究提供一些線索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集41株基因4型HEV毒株血清標(biāo)本。

1.2 方法 （1）引物合成：參照文獻(xiàn)［8］報(bào)道的引物，上游引物為：5'-CATGGCGATGCCACCATGCGC-3'，下游引物為：5 '- TCAGCGGCGAAGCCCCAGCT-3'，目的片段長(zhǎng)度為346 bp，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。（2）病毒RNA提取：取200μl血清，采用Trizol試劑（美國(guó)GIBCO公司）按其說(shuō)明書(shū)提取血清病毒RNA，最后將RNA溶于20μl DEPC水中。（3）RT-nPCR擴(kuò)增：20μl逆轉(zhuǎn)錄體系，以oligo（dT）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（日本TOYOBO公司）42℃逆轉(zhuǎn)錄45min。采用PCR擴(kuò)增HEV cDNA基因片段，PCR反應(yīng)體系含有逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl、dNTP各200μmol/L、引物0.6μmol/L、LA Taq酶1.25U和2×GC buffer 12.5μl，總體積為25μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。（4）DNA純化、測(cè)序及翻譯：PCR產(chǎn)物DNA片段純化試劑盒純化后，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109（大連寶生物工程有限公司），藍(lán)白篩選陽(yáng)性克隆，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序；采用DNAstar軟件將測(cè)序結(jié)果翻譯成氨基酸序列。

2 結(jié)果

19株HEV RNA ORF3基因片段擴(kuò)增陽(yáng)性，其長(zhǎng)度均為345bp，編碼蛋白含有114個(gè)氨基酸，共19個(gè)位點(diǎn)突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無(wú)氨基酸突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，P2區(qū)兩個(gè)PXXP基序無(wú)氨基酸突變。見(jiàn)圖1。

圖1 HEV ORF3蛋白氨基酸變異

3 討論

過(guò)去一直認(rèn)為戊型肝炎病毒（HEV）ORF3的基因長(zhǎng)度為372bp，編碼123個(gè)氨基酸，但后來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ORF3的第三個(gè)AUG才是起始密碼子，致使其編碼蛋白縮短，含有112～114個(gè)氨基酸［9］。

迄今為止，HEV ORF3蛋白的功能研究主要針對(duì)基因1型，研究結(jié)果顯示基因1型HEV ORF3蛋白的N端含有兩個(gè)疏水區(qū)（D1區(qū)和D2區(qū)），C端含有兩個(gè)多脯氨基酸區(qū)（P1區(qū)和P2區(qū)），其中D1區(qū)富含半胱氨酸，與細(xì)胞骨架形成有關(guān)［6］，與Pystl結(jié)合［3］，D2區(qū)與血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合，P1區(qū)存在一個(gè)Ser71磷酸化位點(diǎn)［6］，P2區(qū)兩個(gè)重疊PXXP基序與許多含有SH3結(jié)構(gòu)域的信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合［1］，可見(jiàn)ORF3蛋白的功能主要是通過(guò)某些特異氨基酸區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的，故作者探討基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸變異情況及與基因1型HEV ORF3蛋白比較其氨基酸差異，結(jié)果基因4型HEV ORF3蛋白共19個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無(wú)氨基酸突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，但P2區(qū)兩個(gè)PXXP基序無(wú)氨基酸突變；其中D1區(qū)相對(duì)保守，僅13位點(diǎn)的半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼幔珼2區(qū)主要是丙氨酸和纈氨酸的相互替換，P1區(qū)變異較大，變異率高達(dá)58.33%，以往熟知的71位點(diǎn)不是絲氨酸，而是替換為苯丙氨酸或酪氨酸，Graff J等曾研究表明ORF3蛋白磷酸化在病毒基因組復(fù)制和感染性病毒顆粒產(chǎn)生過(guò)程中并不是必需的［5］，P2區(qū)兩個(gè)PXXP基序高度保守，除具有與含有SH3結(jié)構(gòu)域的信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合的能力外，PSAP基序也與腫瘤易感基因101結(jié)合，從而促進(jìn)α1微球蛋白的分泌，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)［4］，完整的PASP基序是病毒顆粒從感染細(xì)胞內(nèi)釋放必不可少的［7］，據(jù)此推測(cè)PXXP基序在HEV致病過(guò)程中可能起著重要的作用，但上述變異是否影響基因4型HEV ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以致區(qū)別于基因1型HEV ORF3蛋白，仍需進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于基因4型HEV ORF3蛋白的研究較少，而我國(guó)臨床上的HE主要由基因4型HEV感染所致，基因1型所致的相對(duì)較少，所以更應(yīng)加大基因4型HEV ORF3蛋白的功能研究。

［1］ Korkaya H,Jameel S,Gupta D,et al.The ORF3 protein of hepatitis E virus binds to Src homology 3 domains and activates MAPK.J Biol Chem,2001,276(45):42389-42400.

［2］ Chandm V,Kalia M,Hajela K,et al.The 0RF3 protein of hepatitis E virus delays degradation activated growth factor receptors by interacting with CIN85 and blocking fomation of the Cbl-CIN85 complex.J Virol,2010,84(8):3857-3867

［3］ Kar-Roy A,Korkaya H,Oberoi R,et al.The hepatitis E virus open reading frame 3 protein activates ERK through binding and inhibition of the MAPK phosphatase.J Biol Chem,2004,279(27):28345-28357.

［4］ Surjit M,Oberoi R,Kumar R,et al.Enhanced alpha1 microglobulin secretion from Hepatitis E virus ORF3-expressing human hepatoma cells is mediated by the tumor susceptibility gene 101.J Biol Chem,2006,281(12):8135-8142

［5］ Graff J,Nguyen H,Yu C,et al.The open reading frame 3 gene of hepatitis E virus contains a cis-reactive element and encodes a protein required for infection of macaques.J Virol,2005,79(11):6680-6689.

［6］ Zafrullah M,Ozdener MH,Panda SK,et al.The ORF3 protein of hepatitis E virus is a phosphoprotein that associates with the cytoskeleton.J Virol,1997,71(12):9045-9053.

［7］ Nagashima S,Takahashi M,Jirintai,et al.A PSAP motif in the ORF3 protein of hepatitis E virus is necessary for virion release from infected cells?.J Gen Virol,2011,92(Pt2):269-278

［8］ 章述軍,田德英,劉曦.基因 IV型 HEV ORF3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(1) :57-59.

［9］ Graff J,Torian U,Nguyen H,et al.A bicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus.J Virol,2006,80(12):5919-5926

Objective To preliminarily discuss amino acids mutation in the the ORF3 protein of genotype 4 hepatitis E virus（HEV）ORF3 protein. Methods The ORF3 gene fragment of 41 genotype 4 HEV RNA were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction（RTPCR）. The PCR products were connected with pMD18-T Vector.After the recombinant plasmids were transformed into E.coli JM109，the positive clones were obtained and sequenced.Then the sequencing results were translated into amino acid with DNAstar software. The amino acid mutations of genotype 4 HEV ORF3 protein were preliminarily discussed. The amino acids differences between genotype 4 and genotype 1 HEV ORF3 protein were also preliminarily discussed. Results The positive ORF3s were amplified in 19 out of 41 genotype 4 HEV. Its length is 345bp，encoding a protein containing 114 amino acids. There were 19 amino acid sites mutation locating in the D2 region，P1 region and P2 region. The D1 region had no amino acids mutation. Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there were one or multiple amino acid mutations in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. The two PXXP motifs of P2 region had no amino acids mutation. Conclusions Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there are some differences in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. Whether these mutations affect the ORF3 protein structure and function of genotype 4 HEV in China needs to be further studied. But the two PXXP motifs of P2 region are highly conserved，suggesting that they may play an important role in the pathogenesis of different genotypes HEV.

hepatitis E virus ORF3 protein Amino acid mutation

236000 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)醫(yī)院感染科