丹參酮I 對高雄誘導的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影響

陳夏涼 曲凡 金悅?

丹參酮I 對高雄誘導的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影響

陳夏涼 曲凡 金悅?

目的 探討丹參酮I（Tan-I）對高雄誘導的多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠性激素及卵巢功能的影響。方法 通過皮下注射丙酸睪酮建立PCOS大鼠模型。新生雌性Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組，PCOS+Tan-I高、中、低劑量組和PCOS模型組。結果 Tan-I顯著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，顯著升高大鼠血清FSH的表達水平，同時Tan-I顯著升高大鼠卵巢組織中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表達水平。Tan-I對上述因子的改善作用呈劑量相關性。結論 Tan-I通過改善大鼠血清性激素水平以及卵巢功能的表達水平而達到治療PCOS的目的。

丹參酮I 高雄 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女中最常見的婦科內分泌疾病。全球范圍內5%～10%育齡婦女受此病困擾，該疾病以無排卵性月經、不孕、高雄激素血癥和胰島素抵抗為特征［1］。丹參是雙子葉植物唇形科 Labiatae 丹參 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根，其有效成分有脂溶性和水溶性兩大類。近年來，隨著對丹參中各類成分研究的不斷深入，其應用范圍不斷擴大并取得了顯著的療效［2-3］。丹參酮I（Tanshinone I，Tan-I）是丹參主要脂溶性成分之一。本文就Tan-I對高雄誘導的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇新生雌性Sprague-Dawley大鼠15g左右，共50只，由母鼠喂養21d。斷奶后飼養環境為24h明暗循環，自由飲食，溫度25℃，濕度55%。隨機分為正常對照組，PCOS+Tan-I高、中、低劑量組和PCOS模型組，每組各10只大鼠。PCOS造模大鼠于9日齡時以0.004ml/g頸部皮下注射溶于橄欖油中的丙酸睪酮（每25mg丙酸睪酮溶于1ml橄欖油中）［4］。正常對照組大鼠給予相應劑量的橄欖油。PCOS+Tan-I高、中、低劑量組是在PCOS造模的基礎上，分別給予不同劑量的Tan-I灌胃處理：200mg/（kg·d）（高劑量組），100mg/（kg·d）（中劑量組），50mg/（kg·d）（低劑量組）。每日陰道涂片觀察動情周期。PCOS成模標準：從70日齡起，每日行陰道脫落細胞涂片后HE染色觀察，持續10d，若呈現持續角化上皮，提示排卵障礙；卵巢切片可呈現多囊樣改變；血清中雄激素水平升高。

1.2 方法 10周后，處死大鼠，采集外周血及卵巢組織。大鼠卵巢組織干冰預冷后-80℃保存。應用化學發光法檢測血清中黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、總睪酮（total testosterone，TT）的水平，使用儀器為DPCi2000以及相關配套試劑。應用放射免疫分析法檢測血清中雌二醇（estradiol，E2）的水平，檢測使用儀器為上海核所日環光電儀器有限公司生產的SN-6105，使用試劑為天津九鼎醫學生物有限公司出品。采用酶免法（ELISA）檢測血清中性激素結合蛋白（sex hormonebinding globulin，SHBG）的水平，使用酶標儀型號為DENLEY DRAGON Wellscan MK，分析軟件為Ascent software for Multiskan。檢測方法參照說明書進行。應用Real-time PCR檢測各組大鼠卵巢組織中關鍵基因PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達改變，大鼠PPARG1，HDAC3，NCOR1和GAPDH 基因引物由上海生工公司提供。Tan-I購于西安鴻生生物技術有限公司。丙酸睪酮購于美國SIGMA公司。游離雄激素指數（FAI）FAI=TT（nmol/L）/SHBG（nmol/L）×100。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tan-I 對各組大鼠血清性激素水平的影響 除各組大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I高劑量組大鼠血清FSH水平外，其余各組大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均顯著高于正常對照組（P＜0.05）；FSH水平均顯著低于正常對照組（P＜0.05）。除各組大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I低劑量組大鼠血清LH水平外，其余各組大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均顯著低于模型對照組（P＜0.05）；FSH水平均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。除血清E2水平外，Tan-I對PCOS模型大鼠血清LH，FSH，LH/FSH和FAI的改善作用呈劑量相關性。見表1。

表1 各組大鼠血清性激素水平（x±s）

2.2 Tan-I對各組大鼠卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達的影響 正常對照組大鼠卵巢組織中PPARG1mRNA表達水平顯著高于其余各組（P＜0.05）。模型對照組大鼠卵巢組織中PPARG1mRNA表達水平顯著低于其余各組（P＜0.05）。正常對照組大鼠卵巢組織 中NCOR1和HDAC3 mRNA表達水平顯著低于其余各組（P＜0.05）。模型對照組大鼠卵巢組織 中NCOR1和 HDAC3 mRNA表達水平顯著高于其余各 組（P＜0.05）。Tan-I對 PCOS模型大鼠卵巢組織 中PPARG1、NCOR1和 HDAC3 mRNA表達水平的改善作用呈劑量相關性。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達水平

3 討論

丹參始載于《神農本草經》，在歷代本草中均有收載，被列為上品。古代常用于治療月經不調、經閉痛經、癥瘕積聚、肝脾腫大、心絞痛等病癥［2-3］。丹參來源充足，價格低廉，使用方便，臨床進一步深入研究并推廣應用。

PPARG 是核受體轉錄因子超家族的一員，其參與了體內糖脂代謝、細胞增殖凋亡等過程，影響PCOS、肥胖等代謝性疾病的發生。PPARG的不同亞型在生殖和代謝系統中分別發揮著舉足輕重的作用。其中，PPARG1是在卵巢中占主導地位的一個亞型，在卵巢正常功能的維持上起著多方面的關鍵作用，具體涉及了顆粒細胞的增殖與分化，糖-胰島素穩態的維持，甾體激素的生成，卵巢的組織重塑等［5］。Pioglitazone和rosiglitazone 等PPARG的激動劑能夠緩解臨床PCOS患者的高雄癥和排卵障礙［6］，提示PPARG在卵巢卵泡發育中的重要作用，而PCOS 患者存在PPARG 的功能受損。作為核轉錄因子，PPARG 的轉錄活性需要多種共調節子的共同參與協同完成，NCOR1 和HDAC3是其中兩個最重要的共抑制子［7］。NCOR1 是一個具有復雜功能域的大蛋白，其接受核受體的招募而介導轉錄抑制路通，可與HDAC3穩定結合后成為HDAC3 的激活亞單位，其對個體的生殖發育過程至關重要［8］。本研究選擇TT、SHBG、FAI、LH和FSH 反映Tan-I對高雄誘導的PCOS模型大鼠的影響。LH、FSH反映PCOS具有較高的臨床實用價值［9］。SHBG 和FAI是反映PCOS患者高雄狀態的最佳指標，SHBG是調節體內雄激素水平、活性和雌雄激素比例的重要蛋白，其是重要的信號分子，在卵泡等生殖細胞發育成熟中起重要作用［10］。本研究發現Tan-I顯著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，顯著升高大鼠血清FSH的表達水平，同時Tan-I顯著升高大鼠卵巢組織中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表達水平。Tan-I對上述因子的改善作用呈劑量相關性。Tan-I通過改善大鼠血清LH、FSH、LH/FSH和FAI水平以及卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA的表達水平而達到治療PCOS的目的。

［1］ Knochenhauer ES,Key TJ,Kahsar-Miller M,et al.Prevalence of the polycystic ovary syndrome in unselected black and white women of the southeastern United States: a prospective study.J Clin Endocrinol Metab,1998,83(9):3078-3082.

［2］ 朱瑄.丹參的實驗藥理研究進展.中國現代藥物應用,2010,4(15):230-231.

［3］ 鄧惠英.丹參及其有效成分的藥理研究概況.現代醫藥衛生,2007,23(12):1812-1813.

［4］ Tamura N,Kurabayashi T,Nagata H, et al.Effects of testosterone on cancellous bone,marrow adipocytes,and ovarian phenotype in a young female rat model of polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,2005,84 (Suppl 2):1277-1284.

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［7］ Alenghat T, Meyers K, Mullican SE, et al. Nuclear receptor corepressor and histone deacetylase 3 govern circadian metabolic physiology. Nature, 2008, 456(7224):997-1000.

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［9］ Koskinen P,Penttila TA,Anttila L,et al.Optimal use of hormone determinations in the biochemical diagnosis of the polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,1996,65(3):517-522.

［10］ Forges T,Gerard A,Hess K, et al.Expression of sex hormonebinding globulin（SHBG) in human granulosa-lutein cells.Mol Cell Endocrinol,2004,219(1-2):61-68.

Objective To explore the effects of Tanshinone I on the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism. Methods The PCOS model rats were established by injecting subcutaneously with testosterone propionate. The SD rats were randomly divided into normal group，PCOS+ high，medium，low dose of Tan-I and PCOS model group. Results Tan-I significantly decreased the serum levels of LH，LH/FSH，FAI，NCOR1mRNA as well as HDAC3mRNA and increased the serum levels of FSH，PPARG1mRNA expression，which were dose-dependent. Conclusions Tanshinone I can function well in curing PCOS through regulating the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism.

Tanshinone I Hyperandrogenism Polycystic ovary syndrome

浙江省中醫藥科技計劃項目（2015ZB024）

310003 浙江大學醫學院附屬第一醫院（陳夏涼 金悅）310006 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院（曲凡）*通信作者