河豚毒素DNA適配子核心區域的識別

邵碧英，陳文炳，劉正才，繆婷玉，彭 娟，楊 方

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001）

河豚毒素DNA適配子核心區域的識別

邵碧英，陳文炳，劉正才，繆婷玉，彭 娟，楊 方

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001）

用DNA folding form在線軟件分析河豚毒素DNA適配子A3、G10的二級結構，根據二級結構，分別合成適配子A3、G10的各4 個區域的5’端地高辛標記的序列。用丙烯酸-環氧乙烷珠子固定河豚毒素，測定抗地高辛堿性磷酸酶的適宜稀釋倍數，用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶系統檢測各區域與河豚毒素的親和力，識別出適配子的核心區域。結果表明，抗地高辛堿性磷酸酶的適宜工作濃度為2×104倍稀釋；合成的適配子A3的4 個區域中，A3-2區域與河豚毒素的親和力最強，即適配子A3的核心區域為A3-2區域，實際上含有47 個核苷酸；合成的適配子G10的4 個區域中，G10-4區域與河豚毒素的親和力最強，即適配子G10的核心區域為G10-4區域，實際上含有56 個核苷酸。

河豚毒素；適配子；核心區域；親和力

適配子（也稱適體）是通過指數富集配基的系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術從人工合成的DNA或RNA隨機庫中篩選出來的，與非核酸靶物質特異結合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。適配子在蛋白質[1-5]、病毒[6]、細菌[7-9]、生物毒素[10-16]、重金屬[17-18]、小分子物質[19-23]等的篩選、制備及應用方面的報道已有不少。河豚毒素是毒性最強的非蛋白類神經毒素之一，是一種小分子物質，在采用SELEX技術篩選制備其DNA適配子的研究上已取得一定進展，應用SELEX技術、結合誘變聚合酶鏈式反應技術，通過克隆、測序、親和力測定等手段，從人工合成的隨機ssDNA文庫中篩選、制備了2 條能特異結合河豚毒素且親和力強的DNA適配子A3和G10，并進行了初步應用，在河豚毒素的分子生物學檢測、化學分析中有較好的效果[24-26]。但是，有文獻報道，經過實驗篩選獲得的適配子在實際應用中起主要作用的只是其中的一小部分核苷酸，即所謂的核心區域[3]。一旦識別出適配子的核心區域，剔除了不需要的核苷酸部分，既有利于適配子二級結構的形成使之更易與靶物質結合，又便于人工合成，減少成本。因此，本實驗在前期研究成果[25-26]基礎上，以制備的河豚毒素DNA適配子為研究對象，分析其二級結構，根據二級結構合成不同區域的地高辛標記的序列，采用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶系統測定各區域與河豚毒素的親和力，從而識別出適配子A3、G10的核心區域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚毒素（純度≥99%，HPLC純） 成都曼思特生物技術有限公司；丙烯酸-環氧乙烷珠子 美國Promega公司；抗地高辛堿性磷酸酶 艾美捷科技有限公司；對硝基苯磷酸二鈉 廈門泰京生物技術有限公司；DNase/RNase-Free Deionized Water（ddH2O）天根生化科技（北京）有限公司；結合緩沖液、磷酸鉀緩沖液、洗滌緩沖液、封閉液、對硝基苯磷酸二鈉溶液、酶終止液參照文獻[24]配制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Mikro 120臺式高速離心機 德國Hettich zentrifugen公司；SpectraMax M5多功能酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 適配子二級結構的分析及各區域的合成

將適配子A3、G10的序列用DNA folding form在線軟件進行二級結構分析[27]。根據二級結構，選擇不同的區域，委托上海生工生物工程技術有限公司合成5’端地高辛標記的序列。加ddH2O將序列稀釋至50 μmol/L，-20 ℃保存備用。

1.3.2 河豚毒素的固定

加1 mL體積分數為1%的乙酸溶液，將1 mg河豚毒素干粉完全溶解，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）稀釋至質量濃度為100 mg/L；稱取250 mg丙烯酸-環氧乙烷珠子，加入1 mL稀釋后的河豚毒素溶液，渦旋混勻，在室溫條件下放置48 h；用0.01 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）懸浮珠子，在垂熔漏斗中用至少10 mL相同緩沖液漂洗，真空抽濾；加入1 mL含體積分數為5%的水合巰基乙醇的1 mol/L甘氨酸溶液（pH 7～8），室溫條件下放置16 h；將珠子置于垂熔漏斗上，先用10 mL ddH2O后用10 mL 0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）沖洗，真空抽濾；加入25 mL結合緩沖液，使河豚毒素-珠子的質量濃度為10 mg/mL。

1.3.3 抗地高辛堿性磷酸酶適宜稀釋倍數的測定

加500 μL ddH2O溶解抗地高辛堿性磷酸酶干粉，再加500 μL滅菌甘油，混勻，分裝成100 μL/管，-20 ℃保存；用結合緩沖液將抗地高辛堿性磷酸酶分別進行5×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105倍稀釋；各取200 μL抗地高辛堿性磷酸酶溶液，加200 μL對硝基苯磷酸二鈉溶液，顯色20 min；加200 μL NaOH溶液（2 mol/L），終止顯色反應。在30 min內，吸取200 μL反應液于酶標微孔中，于多功能酶標儀測定OD405nm值。

1.3.4 核心區域的識別

1.5 mL離心管先用封閉液于37 ℃封閉4 h，用洗滌緩沖液洗滌1 次，風干；用結合緩沖液將各區域序列稀釋至1 μmol/L，95 ℃變性5 min，冷卻至室溫；在封閉管中加入100 μL河豚毒素-珠子和150 μL各區域序列，同時以不加序列的河豚毒素-珠子為空白對照，各重復3 管，室溫結合30 min，期間不斷渦旋；瞬離，棄上清液，加600 μL結合緩沖液漂洗，重復3 次；加入200 μL經1.3.3節測定的適宜稀釋度的抗地高辛堿性磷酸酶，室溫條件下放置20 min，期間不斷渦旋；瞬離，棄上清液，漂洗3 次；加入200 μL對硝基苯磷酸二鈉溶液，顯色20 min；加200 μL NaOH（2 mol/L）溶液，中止顯色；吸取200 μL于酶聯板的微孔中，測定OD405nm值。

2 結果與分析

2.1 適配子二級結構的分析結果

圖1 適配子的二級結構Fig.1 Secondary structures of DNA aptamers A3 and G10

適配子A3的序列為：5’-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AAC CCT GCC GGG GGC TTC TCC TTG CTG CTC TGC TCT GTT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3’，共78 個堿基。適配子G10的序列為：5’-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AAC CGC GGT TCC TCG GCC CCC CGT CCA TGT CGA GCC TCG AAT ACT CCC CAG ATG TAG TAG CCC ACA GCA TAG TTC GAC ATG AGG CCC GGA TC-3’，共113 個堿基。經DNA folding form在線軟件分析，獲得的適配子A3、G10的二級結構如圖1所示。A3的二級莖環結構明顯地被分為2 個部分，分別由5’-GAG CTC AGA ATA AAC GCT C-3’、5’-CCG GGG GCT TCT CCT TGC TGC TCT GCT CTG TTC GAC ATG AGG CCC GG-3’這2 段序列組成。G10的二級莖環結構明顯地被分為3 個部分，分別由5’-AAA CGC TCA ACC GCG GTT-3’、5’-CGG CCC CCC G-3’、5’-CAT GTC GAG CCT CGA ATA CTC CCC AGA TGT AGT AGC CCA CAG CAT AGT TCG ACA TG-3’這3 段序列組成。

2.2 區域的選擇結果

根據適配子二級結構的分析結果，又考慮到合成序列的5’端需標記地高辛，為了不影響完整的二級結構的形成，參考文獻[2]，在選取的各個區域的5’端多出3個堿基，在3’端多出1 個堿基。A3、G10各選取了4 個區域（表1），其中A3-3、A3-4是A3-2的部分區域，G10-3包括了G10-1和G10-2兩個部分。用DNA folding form軟件分析后，選取的各區域的二級結構不受增加的堿基的影響，且與在適配子A3、G10二級結構中的莖環結構完全一致。

表1 選擇的區域及二級結構Table1 Regions selected and their secondary structures

2.3 河豚毒素的固定

河豚毒素是一種小分子物質，在測定河豚毒素與各區域的親和力時，需要固定河豚毒素。河豚毒素的分子式為C11H17O8N3，結構特征是有1 個碳環，1 個胍基，6 個羥基，在C-5和C-10位有一個半醛糖內酯連接著的分開的環（圖2）。丙烯酸-環氧乙烷珠子具有化學穩定性高、極端的機械強度、非常良好的流動性能、良好的結合能力以及在pH值在0～12范圍不受限制的適用性等優點，它通過環氧乙烷基團可以與蛋白質、硫醇、羥基和胺反應。鑒于河豚毒素和丙烯酸-環氧乙烷珠子的特性，因此完全可以用丙烯酸-環氧乙烷珠子來固定河豚毒素。

圖2 河豚毒素的分子結構Fig.2 Molecular structure of tetrodotoxin

2.4 抗地高辛堿性磷酸酶適宜稀釋倍數的測定結果

隨著抗地高辛堿性磷酸酶稀倍數的增加，加入底物后顯色反應越來越弱，黃色越來越淺，稀釋度為5×103、1×104、2×104時，顏色均很明亮（圖3）。OD405nm值也隨著稀釋倍數的增加而減小，同一稀釋度的平行3 管的讀數接近，重復性好（表2）。當稀釋度為1×104時，顏色過深超出了儀器的讀數范圍，而當稀釋度為2×104時，OD405nm即為正常值，所以選擇2×104為抗地高辛堿性磷酸酶的適宜稀釋倍數。

圖3 不同稀釋倍數的抗地高辛堿性磷酸酶的顯色結果Fig.3 Coloration results of anti-digoxin alkaline phosphatase diluted at different ratios

表2 不同稀釋倍數的抗地高辛堿性磷酸酶的OD405nm測定值Table2 OD405nmvalues of anti-digoxin alkaline phosphatase diluted at different ratios

2.5 核心區域的識別結果

核心區域是通過測定各區域與河豚毒素的親和力來進行識別的，而各區域與河豚毒素親和力的強弱通過酶標儀測定的OD405nm值的大小來反映，數值越大親和力越強，OD405nm值最大或與原適配子接近的區域即為核心區域。親和力測定結果如表3所示。對于適配子A3，選定的4 個區域中，A3-1區域的OD405nm值與空白對照接近；A3-2區域的OD405nm值最大且稍大于適配子A3的OD405nm值；A3-3、A3-4區域的OD405nm值雖然大于A3-1區域，但都低于A3-2區域。對于適配子G10，選定的4 個區域中，G10-1、G10-2、G10-3區域的OD405nm值均低于G10，而G10-4區域的OD405nm值最大且稍大于適配子G10的OD405nm值。結果表明，原先含有78 個核苷酸的適配子A3的核心區域為A3-2區域，實際上含有47 個核苷酸；原先含有113 個核苷酸的適配子G10的核心區域為G10-4區域，實際上含有56 個核苷酸。

表3 各區域與河豚毒素親和力的OD405nm測定結果Table3 Results for the determination of aff i nity between each region with tetrodotoxin

3 討 論

河豚毒素是一種毒性很強的小分子物質，目前使用較普遍的檢測方法是色譜法[28]、色譜-質譜聯用法[29]、液相色譜-熒光檢測法[30]等，這些方法雖然特異性強、靈敏度高，但都需要昂貴的儀器且有很強的基質抑制效應。本實驗成功篩選到2 條能與河豚毒素特異結合、親和力高的DNA適配子A3、G10，建立了基于DNA適配子的河豚毒素分子生物學檢測方法，無需昂貴的儀器和復雜的操作，具有操作簡便、成本低廉、快速、靈敏等優點[26]，應用于色譜檢測法中能很好地解決基質抑制效應[24]。適配子的二級結構是適配子能與靶物質結合的結構基礎，適配子的寡核苷酸之間可以通過堿基的相互作用，形成各種形狀的空間結構，如發卡、莖-環、凸環、G-四分體、假結等，這些結構通過靜電引力、分子間氫鍵、分子堆積及形狀互補匹配等作用形式與靶物質特異性結合，形成穩定的靶物質-核酸適體復合物。在國內，雖然有多篇適配子（適體）的篩選及應用的研究報道，但是還未見識別適配子核心區域的研究報道。河豚毒素DNA適配子A3、G10均包括了兩端固定序列和采用SELEX技術從隨機序列庫中篩選到的特定序列[20-21]，本實驗在分析適配子二級結構的基礎上對其核心區域進行了識別。

本實驗先前是采用DNAMAN軟件對適配子進行二級結構的分析[24-26]，根據分析得到的二級結構合成各區域的序列，但是親和力測定結果都不滿意。參考了國外的研究報道[3,27]，采用DNA folding form在線軟件來分析適配子的二級結構，終于獲得滿意結果，識別出適配子的核心區域。將適配子A3由78 個堿基縮短為47 個堿基，將GA10從113 個堿基縮短為56 個堿基，降低了合成序列的成本。從親和力測定結果看，2 個核心區域與河豚毒素的親和力均大于原適配子，可能與序列縮短了、避免了額外無關序列的干擾更容易形成穩定的二級結構，從而更有利于與河豚毒素的結合有關。識別到的2 個核心區域均較長，其二級結構均較復雜，有可能是由于河豚毒素是小分子物質，越復雜的二級結構越有利于與河豚毒素的結合。河豚毒素DNA適配子A3的核心區域A3-2以及適配子G10的核心區域G10-4的應用效果如何尚待研究。

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Identif i cation of Core Region of DNA Aptamers against Tetrodotoxin

SHAO Biying, CHEN Wenbing, LIU Zhengcai, MIAO Tingyu, PENG Juan, YANG Fang
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

The secondary structures of DNA aptamers A3 and G10 against tetrodotoxin were analyzed using DNA folding form online software. Further, digoxin labeled 5’ end sequences of four regions in each aptamer were separately synthesized. Tetrodotoxin was fixed by acrylic acid-epoxy ethane beads. The core regions of these aptamers were identified using digoxin-anti digoxin alkaline phosphatase system to detect the affinity of these various regions with tetrodotoxin, after determining the appropriate dilution ratio of anti-digoxin alkaline phosphatase. The results showed that the suitable working concentration of anti-digoxin alkaline phosphatase was 2 × 104times dilution. The core region of aptamer A3 was A3-2 area which had the strongest aff i nity with tetrodotoxin among the four regions, including 47 nucleotides, while the core region of aptamer G10 was G10-4 area, including 56 nucleotides.

tetrodotoxin; aptamer; core region; aff i nity

10.7506/spkx1002-6630-201704042

Q78

A

1002-6630（2017）04-0260-05

邵碧英, 陳文炳, 劉正才, 等. 河豚毒素DNA適配子核心區域的識別[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 260-264. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704042. http://www.spkx.net.cn

SHAO Biying, CHEN Wenbing, LIU Zhengcai, et al. Identif i cation of core region of DNA aptamers against tetrodotoxin[J]. Food Science, 2017, 38(4): 260-264. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704042. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家質檢總局科技計劃項目（2014IK104）

邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品生物學分子檢測。E-mail：byshao@sohu.com