基于抗單增李斯特菌單鏈抗體的膠體金探針制備及其活性鑒定

劉愛平，葉子熊，馬 榆，張周莉，熊 清，李文麗，孫海芹，李 誠

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

基于抗單增李斯特菌單鏈抗體的膠體金探針制備及其活性鑒定

劉愛平，葉子熊，馬 榆，張周莉，熊 清，李文麗，孫海芹，李 誠*

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

以大腸桿菌表達系統制備抗單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）的單鏈抗體，以膠體金作為示蹤物，優化膠體金探針的制備，并經免疫滲濾法鑒定膠體金探針的活性。結果表明該膠體金探針應用于免疫滲濾法時，具有高度特異性，通過膠體金探針的直接顯色，可判斷陽性樣品；對Lm的最低檢測限約為107CFU/mL；完成檢測過程僅需10 min左右。該方法簡單、快速、準確，可用于食品中Lm的檢測。

單增李斯特菌；單鏈抗體；膠體金；免疫滲濾

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）簡稱單增李斯特菌，是一種對人畜危害較大的人獸共患病原菌[1]，肉、奶、蛋、水產品、蔬菜以及冷凍食品等均受到不同程度的污染[2]。因此對Lm的分析檢測顯得極其重要。Lm的分析檢測方法主要包括傳統的分離鑒定法[3]、顯色培養基快速檢測法[4]、分子生物學方法[5]及基于抗原-抗體反應的免疫學方法[6-7]等。免疫分析技術因操作簡單、反應迅速、檢測靈敏等優點在食品檢測領域得到廣泛運用[8]。

抗體是免疫分析技術的核心試劑，常用的免疫分析方法中多采用單克隆抗體和多克隆抗體，前者特異性強、靈敏度高，但制備復雜、價格較昂貴；后者批間差異大，且易伴隨高交叉反應率[9]。基因工程抗體是隨著分子生物學技術而發展起來的第3代抗體，其具有制備簡單、生產周期短、成本低等特點[10]。基因工程抗體主要包括抗原結合片段、可變區片段、單鏈抗體（single chain Fv antibody fragment，scFv）、納米抗體等。scFv是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過15～20 個氨基酸的短肽連接而成[11]。scFv能較好地保留其對抗原的親和活性，并具有分子質量小、易于體外表達等特點，廣泛用于食品安全檢測等方面[12-13]。

本研究參考文獻報道合成經密碼子優化適宜大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）表達的Lm scFv基因[14]，構建pET-22b-scFv重組載體，在E. coli BL21(DE3)中表達純化；以檸檬酸三鈉法制備膠體金，與純化的scFv結合制備膠體金探針；采用免疫滲濾法檢測該膠體金探針的活性。本研究可為實現食品中的Lm快速篩查、現場快檢提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菌株：Lm、E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)感受態細胞、pET-22b質粒由課題組保存；SanPrep柱式聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物純化試劑盒、兔源抗組氨酸多克隆抗體 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內切酶（NcoⅠ、XhoⅠ）、PCR Master mix 日本Takara公司；WesternBright ECL化學發光底物 美國Advansta公司；氯金酸 美國Sigma公司；硝酸纖維素膜 美國Pall公司；其他常規試劑均為國產分析純。

ST 16R臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；JY 92-IIN超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統、Chem DocTMXRS+成像系統 美國Bio-Rad公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；WP700P21微波爐格蘭仕集團。

1.2 方法

1.2.1 重組載體pET-22b-scFv的構建

參考Paoli等[14]的研究，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成密碼子經優化（適于E. coli表達系統）的抗Lm scFv基因片段，采用含NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點的5’和3’引物擴增scFv基因片段。分別對scFv基因片段與pET-22b質粒進行Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，以SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒純化酶切產物。酶切后的scFv基因片段與pET-22b質粒按物質的量比6∶1進行連接；將連接產物轉化至E. coli DH5α感受態細胞，在LB-A（含100 μg/mL氨芐青霉素）固體培養基上37 ℃過夜培養，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，將疑似正確的克隆菌株測序驗證。

1.2.2 抗Lm scFv的表達與純化

將測序驗證的克隆菌株在液體培養基中擴大培養，提取重組載體pET-22b-scFv，轉化至E. coli BL21(DE3)感受態細胞，以菌落PCR驗證陽性克隆。挑取單個陽性克隆菌落接種至LB-AG液體培養基（含0.5%葡萄糖和100 μg/mL氨芐青霉素），110 r/min，37 ℃培養，待OD600nm至0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG），于16 ℃誘導表達12 h后將菌液離心，棄上清液。以結合（binding，BD）緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗3 次，重懸菌體于20 mL BD緩沖液，在冰浴條件下超聲破碎菌體（超聲30 min，2 s 開啟，2 s切斷，功率105 W）。將超聲后混合液在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，采用His標簽純化樹脂親和純化上清液，并以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot分析scFv表達與純化效果。

1.2.3 膠體金制備

參考劉穎沙等[15]報道，對制備膠體金的各種玻璃器具進行清洗，高溫干燥，備用。采用檸檬酸三鈉法制備膠體金，并對檸檬酸三鈉的加入量進行優化。具體方案如下：取5 瓶40 mL 0.01%氯金酸分別加入1%檸檬酸三鈉0.4、1.2、1.6、2.4 mL和4.8 mL，充分混勻后，置于微波爐中小火加熱15 min。

通過目測得到膠體金的外觀特征，同時以紫外-可見分光光度計對各條件下制備的膠體金在可見光波長范圍（400～700 nm）進行掃描并記錄結果。

1.2.4 膠體金探針的制備

1.2.4.1 最適標記pH值的確定

取50 μL pH值分別為6、7、8、9和10的膠體金溶液，加入至96 孔酶標板，向各孔依次加入純化的scFv，使其終質量濃度達到25 μg/mL，振蕩混合后室溫放置10 min。每孔加入10 μL 10%氯化鈉溶液，振蕩混合后室溫放置2 h，觀察各孔顏色變化。取膠體金溶液保持紅色不變的pH值，重復上述過程，但將scFv終質量濃度降至5、4、3、2 μg/mL和1 μg/mL，觀察各孔顏色變化。取膠體金溶液仍保持紅色不變的pH值為最適標記pH值。

1.2.4.2 最適scFv標記量的確定

取pH值調至最適值的膠體金溶液50 μL分別加入至96 孔酶標板，各孔依次加入不同量的純化scFv，使其質量濃度達到0、10、15、25、30、40 μg/mL，振蕩混合后室溫放置10 min。每孔加入10 μL 10%氯化鈉溶液，振蕩混合后室溫放置2 h，觀察各管顏色變化。使得膠體金溶液保持紅色不變的最小抗體用量即為最低穩定量，在此基礎上再加20%即為最適穩定量。

1.2.4.3 膠體金探針的制備和純化

將1.2.2節中純化的scFv置于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 8.0）中透析24 h，將透析后的scFv于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液。用0.1 mol/L的HCl溶液和K2CO3溶液調節至最佳pH值，調整scFv添加量至最適穩定量，搖勻15 min，室溫放置10 min；加入牛血清白蛋白至其終質量分數為1.5%，緩慢搖勻10 min。將標記的膠體金溶液于4 000 r/min離心20 min，收集上清液；4 ℃條件下于13 000 r/min離心50 min，棄上清液；以原體積1/10的膠體金探針稀釋液（質量分數為1%的牛血清蛋白溶液）重懸沉淀，加入疊氮鈉至其終質量分數為0.02%，置4 ℃保存備用[16]。

1.2.5 膠體金探針的活性鑒定

1.2.5.1 菌懸液的制備

將受檢菌種Lm、E. coli DH5α分別在含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯培養基和LB培養基中培養，取少量培養液進行平板稀釋法計數；剩余菌液離心收集，并采用PBS洗滌3 次，4 ℃保存備用。

1.2.5.2 活性鑒定

采用免疫滲濾法對上述膠體金探針活性進行檢測，具體步驟參考諶志強等[17]研究，略有改動。在硝酸纖維素膜上分別滴加不同稀釋度的菌樣4 μL，待滲入，加4 μL 5%脫脂牛奶封閉液（溶于0.1% PBST，含0.1%吐溫-20的PBS），待滲入，加6 μL膠體金探針，待滲入，加10 μL洗滌液（0.1% PBST），觀察結果。

2 結果與分析

2.1 重組載體pET-22b-scFv的構建

按照1.2.1節中方法構建重組載體pET-22b-scFv，并轉化至克隆菌株E.coli DH5α，經菌落PCR驗證（圖1），得到大小約750 bp的片段，與理論值一致。然后將克隆菌株測序，驗證重組載體構建成功。

圖1 克隆菌株菌落PCR驗證Fig.1 PCR verif i cation of monoclonal colonies

2.2 抗Lm scFv的表達與純化

液體培養基擴大培養克隆菌株，提取質粒并轉化至表達菌株E.coli BL21(DE3)，再次經PCR驗證轉化成功（圖2）。按照1.2.2節方法誘導scFv表達，并采用SDS-PAGE和Western blot對scFv表達情況進行分析，結果見圖3。在同等菌濃度條件下（條帶1～3），含重組質粒pET-22b-scFv的E.coli BL21(DE3)經IPTG誘導后，在12% SDS-PAGE膠上出現更明顯的大小約27 kD的蛋白條帶（圖3A），經過His標簽純化樹脂親和純化后，獲得的scFv在27 kD和54 kD左右顯示出條帶，且當采用兔源抗組氨酸多克隆抗體進行Western blot反應時，在27 kD和54 kD左右處也顯示條帶（圖3B）。27 kD處條帶符合scFv預估分子質量大小，54 kD處條帶的出現可能是由于scFv形成了二聚體[11]。

圖2 表達菌株菌落PCR驗證Fig.2 PCR verif i cation of monoclonal colonies

圖3 scFv表達的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）分析Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analyses of scFv expression

2.3 檸檬酸三鈉還原法制備膠體金

表1 檸檬酸三鈉加入量對膠體金溶液最大吸收波長、平均粒徑的影響Table1 Effect of sodium citrate concentration on the maximum absorption wavelength and average particle size of colloidal gold

研究者多用檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、硼氫化鈉為還原劑制備膠體金，其中檸檬酸三鈉法最常用。通過改變反應體系中還原劑的量可得到不同直徑的金顆粒[18]。本研究探索了在40 mL 0.01%氯金酸溶液體系中，檸檬酸三鈉加入量對膠體金顆粒大小的影響。添加0.4、1.2 mL的1%檸檬酸三鈉溶液所得到的膠體金的顏色偏紫色；當添加1.6、2.4、4.8 mL的1%檸檬酸三鈉溶液時，制得的膠體金顏色為酒紅色，視覺效果良好、透明度高、無懸浮顆粒出現。采用紫外-可見分光光度計對不同檸檬酸三鈉溶液添加量條件下制備的膠體金進行全波長掃描（400～700 nm），根據膠體金的最大吸收峰波長與平均粒徑的線性關系回歸方程Y = 0.427 1X+514.56（X為納米金平均粒徑；Y為最大吸收峰），可得到膠體金的粒徑（表1）。結合膠體金顏色及前人研究報道中膠體金的粒徑[19]，確定本實驗中，40 mL質量分數為0.01%的氯金酸溶液中，質量分數1%檸檬酸鈉溶液的最佳添加量為2.4 mL，加熱時間為15 min。

2.4 最適標記pH值和scFv標記量的確定

膠體金探針的最適標記pH值和scFv的最佳標記量實驗結果見圖4，由圖4A可知，pH值為6和10時，膠體金有明顯褪色現象，將每孔的scFv質量濃度分別降至5、4、3、2、1 μg/mL，如圖4B所示，在scFv質量濃度為1 μg/mL和2 μg/mL，pH值為7和8的微孔都有褪色現象，故選擇pH 9為最佳標記pH值。

圖4 最適標記pH和scFv標記量的優化Fig.4 Optimization of pH and scFv concentration for colloidal gold probe

由圖4C、D觀察可知，除空白外其他孔顏色都較為穩定，但15 μg/mL相對10 μg/mL顏色更加鮮艷，故最低scFv穩定量為15 μg/mL，最佳scFv標記量為15 μg/mL的1.2 倍，即18 μg/mL。

2.5 膠體金探針的活性鑒定

圖5 膠體金探針的活性鑒定Fig.5 Determination of the activity of colloidal gold probe

采用免疫滲濾法檢測無菌水、E. coli DH5α、Lm的結果如圖5所示。檢測無菌水時，硝酸纖維素膜上無明顯顏色變化（圖5A）；檢測濃度約108CFU/mL E. coli DH5α時，硝酸纖維素膜上點樣處周圍零散分布紅色斑點（圖5B）；檢測濃度約109CFU/mL E. coli DH5α時，硝酸纖維素膜上點樣處出現較淺的紅色圓圈，靠圓圈邊緣零散分布幾個紅色斑點（圖5C）；這可能是由于菌液擴散引起的。當Lm濃度達到107CFU/mL時（圖5D），點樣處即出現明顯的紅色圓圈，且圈內有大量紅色斑點；該現象與楊小姣[20]的報道一致。

3 討 論

抗體是免疫學分析的核心試劑，基于免疫膠體金探針檢測Lm的免疫學方法多采用多克隆抗體和單克隆抗體[6-7]。隨著分子生物學技術的發展而興起的基因工程抗體備受研究者關注，基因工程抗體可不經動物免疫過程直接篩選獲得，具有成本低、耗時短、易于修飾、可體外利用原核或真核細胞表達等特點[21-23]。本研究以Paoli等[14]報道的scFv氨基酸序列為基礎，優化并合成scFv基因，經E. coli表達系統制備scFv，獲得的scFv特異性強、靈敏度高、且成本低，可為基于免疫學原理的分析技術建立提供優良試劑。

制備高質量的膠體金探針是檢測Lm的前提，其中pH值和標記scFv的用量是兩個重要的影響因素[24]。因此，本研究對這兩個因素都進行了優化。同時，膠體金探針制備后須進行活性鑒定，以確保膠體金探針的可用性。研究結果表明將制備的膠體金探針用于免疫滲濾法時，對Lm的檢測限約為107CFU/mL。但是將該探針置于4 ℃保存28 d后，探針喪失活性，這可能是由于scFv相對完整抗體分子的分子質量小、結構簡單、穩定性較差[11]等原因造成的，因此后續需要研究如何提高膠體金探針的穩定性，增強膠體金探針的易用性。

免疫膠體金技術主要包括膠體金免疫層析和膠體金免疫滲濾法。但研究者多采用免疫層析技術檢測Lm，鮮見免疫滲濾法的報道。崔煥忠[7]、Shim[25]等利用單克隆抗體構建免疫層析法檢測Lm的檢測限均達到105CFU/mL；Ueda等[26]采用商業化免疫層析試劑盒檢測Lm的檢測限為106CFU/mL；熊國華[27]利用多克隆抗體構建免疫層析法檢測Lm的敏感性為106CFU/mL。免疫滲濾法操作過程相對簡單，但本研究的檢測靈敏度仍有提升的空間。

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Preparation and Activity Determination of Colloidal Gold Probe Based on Anti-Listeria monocytogenes Single Chain Fv Antibody Fragment

LIU Aiping, YE Zixiong, MA Yu, ZHANG Zhouli, XIONG Qing, LI Wenli, SUN Haiqin, LI Cheng*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this study, an anti-Listeria monocytogenes (Lm) single chain Fv antibody fragment was expressed in Escherichia coli. After purif i cation, the antibody fragment was used to prepare a colloidal gold probe with colloidal gold as a tracer and the preparation process was optimized. The activity of the probe was determined by using an immunof i ltration assay. The results showed that the colloidal gold probe exhibited high specificity. Positive samples could be directly identif i ed by color development using the probe. The detection limit (LOD) for Lm was approximately 107CFU/mL and the whole process of immunof i ltration assay took approximately 10 min. The method developed is simple, rapid and accurate, and it could be applied for Lm detection in food samples.

Listeria monocytogenes; single chain Fv antibody fragment; colloidal gold; immunof i ltration assay

10.7506/spkx1002-6630-201704049

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0301-05

劉愛平, 葉子熊, 馬榆, 等. 基于抗單增李斯特菌單鏈抗體的膠體金探針制備及其活性鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 301-305. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704049. http://www.spkx.net.cn

LIU Aiping, YE Zixiong, MA Yu, et al. Preparation and activity determination of colloidal gold probe based on anti-Listeria monocytogenes single chain Fv antibody fragment[J]. Food Science, 2017, 38(4): 301-305. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704049. http://www.spkx.net.cn

2016-06-20

四川省烹飪科學重點實驗室一般項目（PZKX2015Z05）；四川省級大學生創新創業訓練計劃項目（201610626077）

劉愛平（1986—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物與免疫學檢測。E-mail：aipliu@outlook.com

*通信作者：李誠（1964—），男，教授，碩士，研究方向為畜產品加工與質量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com