有氧運動對慢性腦缺血小鼠的PI3K/Akt信號通路的影響

張鐘元+陳嘉勤+陳偉+毛海峰+周柏存+屈紅林+李娣+彭琪

摘 要：目的：探討有氧運動對慢性腦缺血小鼠干預效果及PI3K/Akt信號通路的影響。方法：參考Yoshizaki建立的小鼠慢性腦缺血模型，選擇KM小鼠為實驗動物，構(gòu)建小鼠慢性腦缺血模型；應(yīng)用神經(jīng)行為學分析、尼氏染色、免疫組化實驗技術(shù)，比較有氧運動對該模型的干預效果，探討其神經(jīng)保護作用的機制；建模成功后，將小鼠隨機四組：SO組、M組、SW組、TM組。SW組：術(shù)后3～4天適應(yīng)性游泳30分鐘，繼后每天遞增10分鐘，逐漸延長至60分鐘，持續(xù)6周，每周休息1天。TM組：術(shù)后第1周進行3次適應(yīng)性跑臺訓練，每次60分鐘，每周6次，持續(xù)6周。結(jié)論：兩種有氧運動均能對本模型的腦細胞發(fā)揮抗損傷作用，且其干預效果TM組優(yōu)于SW組；兩種有氧運動可能均通過調(diào)節(jié)PI3K /Akt信號通路的表達，達到抑制細胞凋亡，發(fā)揮其抗腦組織傷害的作用。

關(guān)鍵詞：有氧運動；慢性腦缺血；PI3K；Akt；信號通路

慢性腦缺血是指各種原因引發(fā)的長期腦血流灌注不足，為臨床上常見的腦損傷之一，可導致持久或進展性的認知與神經(jīng)功能障礙[1]。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是細胞在某些生理或病理條件下發(fā)生的有序的主動性非炎癥性死亡。研究認為，腦缺血后與細胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），為分子量大約為60 kD的蛋白激酶。Akt能使絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt能介導多種生物學效應(yīng)，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。因子PI32K激活的Akt可以介導胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發(fā)的細胞生長，能經(jīng)多種途徑促進細胞存活[3]。

本研究采用結(jié)扎右頸動脈的方法構(gòu)建了小鼠酒精性肝損傷模型，采用跑臺和游泳兩種不同的有氧運動方式干預，通過神經(jīng)行為學、顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學觀察以上干預對腦缺血損傷小鼠的影響；采用免疫組化實驗技術(shù)，檢測PI3K/Akt信號通路上下游相關(guān)因子的差異表達，探討其神經(jīng)保護作用的機制。

1.研究方法

（1）動物模型的構(gòu)建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g體重），參考Yoshizaki的方法結(jié)扎小鼠右頸動脈構(gòu)建慢性腦缺血損傷小鼠動物模型。

（2）實驗動物分組以及運動方案：建模成功后，將小鼠隨機分為四組：假手術(shù)組（SO）、模型對照組（M）、游泳組（SW）、跑臺組（TM），每組10只，建模后3—4天對其進行干預。

（3）組織形態(tài)學觀察：實驗結(jié)束后，取小鼠腦組織進行石蠟包埋，尼氏染色，解剖形態(tài)學觀察。

（4）神經(jīng)行為學評估：Clark神經(jīng)功能評分方法，根據(jù)癥狀表現(xiàn)程度分0、1、2、3、4遞增等級，對小鼠步態(tài)、攀爬能力、轉(zhuǎn)圈、胡須反應(yīng)、眼睛、耳朵、毛發(fā)等的情況進行綜合評分。

（5）免疫組織化學分析：檢測缺血腦組織中的PI3K、Akt、mTOR的表達，采用SABC法的免疫組織化學法進行以上因子的定位和半定量表達檢測。在10×20倍光學顯微鏡下，觀察并計算PI3K、AKT、mTOR的陽性表達面積百分比[4]（陽性反應(yīng)面積/測量面積）。

2.結(jié)果與分析

（1）小鼠神經(jīng)行為學評估：分別記錄建模后無干預和建模后進行有氧干預的得分（三次評分取平均值）。

（2）解剖形態(tài)學觀察：組小鼠尼氏體排列緊密，大且數(shù)量較多，神經(jīng)元受損程度小；M組排列疏、欠規(guī)整，且數(shù)量較少；與M組相比，SW、TM組中尼氏體數(shù)量較多，排列緊密，僅次于SO組，TM排列有規(guī)則較集中，效果優(yōu)于SW組。

（3）免疫組織化學分析。圖2顯示：小鼠腦細胞PI3K、Akt主要表達于細胞漿。PI3K表達強弱依次為SO>TM>SW>M組；Akt表達強到弱依次為SO>TM>SW>M組。

表2可見：小鼠腦組織中PI3K、Akt免疫組化中SO組陽性表達最高，SW組、TM組表達均高于M組（P<0.01），且TM組表達更顯著；與M組的Akt表達相比，SO組的Akt表達具有非常顯著的差異（P<0.01）。

3.討論

（1）小鼠腦缺血模型。腦缺血理想的實驗動物模型是實驗研究取得進展的關(guān)鍵性因素之一。由于本實驗需要進行長時間的有氧游泳和跑臺的運動訓練，我們對所選小鼠的右頸動脈進行結(jié)扎以構(gòu)模。術(shù)后我們跟蹤觀察小鼠的情況，發(fā)現(xiàn)小鼠右眼半閉或全閉。這說明小鼠建模成功，且其成功率達90%，應(yīng)用此模型可以順利完成本研究。

（2）有氧運動對小鼠腦缺血干預的效果。近年來，大量有關(guān)有氧運動康復訓練治療急性缺血性腦血管疾病的動物實驗取得了一定的成果。適當?shù)倪\動訓練能夠促使腦血管新生，增強抗氧化能力，減輕腦細胞凋亡，促進神經(jīng)元生長等。從本實驗結(jié)果可見，對小鼠建模前、后以及有氧運動干預后神經(jīng)功能的評分，除M組外，各干預組都有明顯的變化。腦組織尼氏染色顯示，相比于M組，有氧運動組尼氏小體相對清楚有規(guī)律，TM組尤為顯著，這說明有氧運動對小鼠腦部神經(jīng)元細胞的再生以及保護有著重要的作用，其能促進神經(jīng)干細胞增殖以及分化，促進軸突及樹突的生長。

（3）有氧運動干預與PI3K/Akt信號通路表達影響。腦缺血后與細胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂產(chǎn)物進一步激活Akt及其下游的信號的級聯(lián)反應(yīng)， 參與生長、發(fā)育、分化和細胞的存活。PI3K激活的Akt可以介導胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發(fā)的細胞生長，能經(jīng)多種途徑促進細胞存活。從小鼠腦組織免疫組織化學結(jié)果的分析可見，PI3K/Akt的表達情況在游泳組和跑臺組的表達面積遠高于模型對照組、低于假手術(shù)組，且跑臺組表達面積更佳。由此可知，有氧運動對該模型中的鼠腦組織發(fā)揮著保護作用，能抑制細胞的凋亡過程。其抗損傷作用機理可能通過激活PI32K /Akt信號通路的表達，達到抑制細胞凋亡，發(fā)揮腦組織保護的作用。

4.結(jié)論

（1）兩種有氧運動均能對本慢性腦缺血小鼠模型的腦細胞發(fā)揮抗損傷作用，且其效果跑臺組優(yōu)于游泳組。

（2）兩種有氧運動可能均通過調(diào)節(jié)PI32K /Akt信號通路的表達，達到抑制細胞凋亡，發(fā)揮抗腦組織傷害作用。

參考文獻：

[1]楊運華.運動對胰島素抵抗狀態(tài)下胰島素PI3K/Akt/GSK-3信號傳導通路影響的研究進展[J].長江大學學報（自然科學版），2013（21）：142-145.

[2]黃秀蘭，崔國輝，周克元.PI3K/Akt信號通路與腫瘤細胞凋亡關(guān)系的研究進展[J].癌癥，2008，27（3）：331-336.

[3]朱裕華，袁紅花，吳連連，等.IGF-1通過PI3K/Akt信號誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化[J].山東大學學報（醫(yī)學版），2014，52（3）： 11-15.

[4]郭 琳，王 強.PI3K/mTOR信號傳導通路與惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009， 17（8）：1585-1589.

（作者單位：湖南師范大學體適能與運動康復湖南省重點實驗室）