P-選擇素、溶酶體顆粒糖蛋白、血小板活化因子和血漿D-二聚體水平與下肢深靜脈血栓形成的關系

張蘊鑫 劉建龍 賈 偉 田 軒 蔣 鵬 程志遠

(北京積水潭醫院血管外科，北京 100035)

P-選擇素、溶酶體顆粒糖蛋白、血小板活化因子和血漿D-二聚體水平與下肢深靜脈血栓形成的關系

張蘊鑫 劉建龍 賈 偉 田 軒 蔣 鵬 程志遠

(北京積水潭醫院血管外科，北京 100035)

目的 探討血小板表面P-選擇素(CD62P)、溶酶體顆粒糖蛋白(CD63)、血小板活化因子(PAF)、血漿D-二聚體(D-D)與下肢深靜脈血栓形成的關系。方法 171例下肢深靜脈血栓形成患者為病例組，并給予常規治療，采用流式細胞儀檢測治療前、治療后7 d的血漿CD62P和CD63的陽性率，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定治療前、治療后7 d血清PAF和血漿D-D水平，分析CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的關系，并與同期隨機選取60例無血管相關疾病的對照組患者進行比較。結果 病例組治療前CD62P、CD63陽性率及PAF、D-D水平高于對照組(P<0.05)；治療后均降低，且仍高于對照組(P<0.05)。與治療前相比，病例組治療后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差均降低(P<0.05)。經Pearson積矩相關分析，病例組治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差均呈正相關關系(P<0.05)。結論 CD62P、CD63、PAF和血漿D-D與下肢深靜脈血栓形成有密切關系，聯合檢測可作為早期診斷和早期預測下肢深靜脈血栓形成的重要指標。

下肢深靜脈血栓；血小板表面P選擇素；溶酶體顆粒糖蛋白；血小板活化因子；血漿D-二聚體

下肢深靜脈血栓形成的過程中，血小板的活化、血管內皮細胞的損傷在血栓的形成過程中有重要作用。P-選擇素(CD62P)在靜止血小板的α顆粒及活化的血小板質膜上的膜糖蛋白顆粒均有表達，是評估血小板活化的“金標準”〔1〕，溶酶體顆粒糖蛋白(CD63)、D-二聚體(D-D)是反映凝血和纖溶系統成分的指標，當血液處于高凝狀態時血小板功能增強，此時體內血液凝固性增強，同時存在繼發性纖溶性亢進，CD63和D-D水平升高〔2〕，血小板活化因子(PAF)通過促進血小板的聚集而誘導血栓的形成，是反映血小板形成的標志物〔3〕。本研究旨在探討CD62P、CD63陽性率以及血清PAF和血漿D-D水平與下肢深靜脈血栓形成的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年9月至2016年8月我院收治的171例下肢深靜脈血栓形成患者為病例組，納入標準：①所有患者均符合2012年中國中西醫結合研究會周圍血管病專業委員會制定的診斷標準〔4〕；②入院前未接受過抗凝等藥物治療者；③入院前未服用過可能影響血液成分的藥物；④近2 w內未發生過活動性出血。排除標準：①妊娠期及哺乳期婦女；②心臟功能不全者；③肝、腎功能障礙者；④自身免疫性疾病等炎癥反應性疾病者；⑤合并有其他慢性疾病如高血壓、糖尿病者；⑥惡性腫瘤者。其中男95例，女76例；年齡44～75〔平均(53.67±7.82)〕歲。于同期隨機選取60例無血管相關疾病的住院患者為對照組，納入標準：①所有患者未服用過可能影響血液成分的藥物；②既往無靜脈血栓病史及其他血液系統疾病；③無凝血功能障礙者；④無心、肝、腎功能不全者；⑤無外周血管病及腦血管病者；⑥無其他可能影響本研究結果的疾病如急、慢性感染等。其中男34例，女26例；年齡38～76〔平均(51.08±8.91)〕歲。兩組性別構成比、年齡比較無統計學差異(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 貝克曼-ELITE-ESP型流式細胞儀、2%多聚甲醛、D-D試劑盒(上海瑞齊生物科技有限公司)。藻紅蛋白標志物的抗CD62P、CD63-PE、美國RB Human PAF ELISA(血清)試劑盒，同型對照羊抗體LgG1-PE(美國BD公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD61抗體(CD61-FITC)。

1.2.2 標本采集 病例組患者入院后給予常規治療，并于治療前、治療后7 d清晨空腹收集肘靜脈血6 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，對照組在入院后清晨抽取空腹靜脈血6 ml于抗凝管，并且監測患者髕骨上15 cm和髕骨下10 cm處的周徑進行測量，計算周徑差。

1.2.3 測定方法 ①將其中2 ml經EDTA抗凝處理的血液標本1 200 r/min離心5 min，并留取含血小板的血漿，同時保留血清置于-70℃環境下保存，留待檢測PAF。取3只分別加入10 μl 的CD61-FITC試管，然后分別加入10 μl的 LgG1-PE、CD62P-PE、CD63-PE，再在3只試管中加入抗凝全血10 μl富含血小板的血漿以及80 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)液，在室溫環境中避光孵育30 min，再加入含2%多聚甲醛的PBS 500 μl。通過陰性對照管調整電壓后檢測測定管，測到CD62P-PE、CD63-PE，以CD62設門分析CD61門中CD62P、CD63的陽性率，同時分析活化的血小板，CD62P陽性率=(CD61門中標記上CD62P血小板/CD61門中全部血小板)×100%，CD63陽性率=(CD61門中標記上CD63血小板/CD61門中全部血小板)×100%。②同時取2 ml經EDTA抗凝處理的血液標本采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定D-D水平，嚴格按照試劑盒上的說明進行相關操作。③取2 ml經EDTA抗凝處理的血液標本經1 200 r/min離心5 min，留取上清液檢測PAF水平，ELISA法檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗和Pearson積矩相關分析。

2 結 果

2.1 兩組患者CD62P、CD63陽性率及PAF、D-D水平比較 病例組治療前CD62P、CD63陽性率及PAF、D-D水平高于對照組(P<0.05)，治療后7 d均低于治療前且高于對照組(P<0.05)，各組間差異均有統計學意義。見表1。

2.2 病例組患者治療前后患肢與健肢周徑差比較 病例組患者治療后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢與健肢周徑差〔(2.35±0.46)cm、(2.04±0.55)cm〕均小于治療前〔(4.87±0.58)cm、(3.29±0.61)cm;t=44.526、19.902,均P=0.000〕。各組間差異均有統計學意義。

2.3 病例組治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的相關性 病例組患者治療前CD62P、CD63、PAF、D-D與膝上15 cm患肢、膝下10 cm患肢和健肢周徑差均呈正相關(r=0.379、0.426、0.418、0.382；r=0.361、0.398、0.402、0.385，均P<0.05)。

表1 兩組CD62P、CD63陽性率及PAF、D-D水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與病例組治療前比較：2)P<0.05

3 討 論

下肢深靜脈血栓形成約占周圍血管性疾病的60%，如果在急性期階段不能及時診斷并給予有效的治療，可引起靜脈血栓后遺癥以及致命性肺栓塞〔5〕。超聲是下肢深靜脈血栓的主要診斷手段，具有靈敏度高、特異性高的特點，診斷符合率可高達97%，但是，多普勒超聲雖然能診斷下肢深靜脈血栓形成，但是無法確定血栓情況下機體是否處在纖溶狀態，因此不能預測下肢深靜脈血栓形成。正常情況下血小板處于靜息狀態，當受到病理性的刺激時，血小板活化，在血栓形成過程中，血小板的活化具有重要意義，是血栓前狀態的重要指標〔6〕。在血小板活化過程中隨著活化血小板的脫顆粒，靜息血小板胞質內α顆粒膜上的糖蛋白CD62P和溶酶體膜上的CD63與血小板膜融合進行標記〔7〕。CD62P主要存在于靜息狀態下血小板的α顆粒膜上，是反映血小板活化的重要標志物，當血小板出現活化反應時，通過開放的管道系統，血小板內的α顆粒與質膜融合，從而使血小板質膜上的CD62P分子表達量增加〔8〕，CD63作為結構較為獨特的糖蛋白〔4〕。PAF在血小板-中性粒細胞的活化過程中有重要作用，是目前發現最強的炎癥因子和血小板聚集誘導劑。PAF與CD62P具有協同效應，兩者在內皮細胞的表面表達而介導白細胞與血管內皮細胞黏附，同時PAF通過活化白細胞而促進整合素的表達，進而形成穩定的黏附。D-D診斷血栓性疾病具有重要的價值，是反映機體內血液高凝以及纖溶亢進的指標〔9〕。

本研究結果說明下肢深靜脈血栓形成患者體內血小板活化反應較明顯，血小板活化參與了血栓的形成及發展過程，該結果可在一定程度說明CD62P、CD63、PAF、D-D作為下肢深靜脈血栓形成的早期診斷和早期預測指標具有重要意義。另外常規的抗凝、溶栓、抗血小板治療能有效改善患者的病情，降低血小板活化程度。研究還提示通過治療患者仍然存在不同程度的血小板活化，因此對于接受治療的下肢深靜脈血栓形成患者，應考慮增加治療藥物的劑量，治療結束后仍需要定期隨訪。此外，經治療后，患者的血栓有一定程度的改善。而且CD62P、CD63、PAF、D-D與雙下肢周徑差的變化情況一致，因此推斷上述指標可作為早期診斷和早期預測下肢深靜脈血栓形成的重要指標。

1 張紀媛，郭丹青，何 惠.下肢深靜脈血栓患者外周血血小板p-選擇素、D-二聚體及超敏C反應蛋白的表達及臨床意義〔J〕.中國醫藥導報，2014；11(20)：34-6.

2 邊樹疆，朱 兵，田廣磊，等.血漿D-二聚體檢測在下肢深靜脈血栓診斷中的價值〔J〕.現代生物醫學進展，2011；11(19)：3764-6.

3 Vadas P.The platelet-activating factor pathway in food allergy and anaphylaxis〔J〕.Ann Allergy Asthma Immunol，2016；117(5)：455-7.

4 中國中西醫結合學會周圍血管病專業委員會.中國中西醫結合學會周圍血管病專業委員會2012學術年會在上海召開〔J〕.中國中西醫結合雜志，2012；32(12)：1646.

5 Min SK，Kim YH，Joh JH，etal.Diagnosis and treatment of lower extremity deep vein thrombosis：korean practice guidelines〔J〕.Vasc Specialist Int，2016；32(3)：77-104.

6 Barrett TW，Wrenn KD，Slovis CM，etal.An outpatient management protocol for emergency department patients with a newly diagnosed lower extremity deep venous thrombosis〔J〕.Crit Pathw Cardiol，2016；15(3)：75-6.

7 Vandy FC，Stabler C，Eliassen AM，etal.Soluble P-selectin for the diagnosis of lower extremity deep venous thrombosis〔J〕.J Vasc Surg Venous Lymphat Disord，2013；1(2)：117-25.

8 蘆 璐，房淑欣，胡浩然.D-dimer、P-selection、ACA與下肢深靜脈血栓形成和復發的研究〔J〕.中華全科醫學，2013；11(10)：1504-5，1518.

9 Matsuo H，Nakajima Y，Ogawa T，etal.Evaluation of D-Dimer in Screening Deep Vein Thrombosis in Hospitalized Japanese Patients with Acute Medical Diseases/Episodes〔J〕.Ann Vasc Dis，2016；9(3)：193-200.

〔2016-06-27修回〕

(編輯 滕欣航)

劉建龍(1966-)，男，主任醫師，主要從事外周血管疾病研究。

張蘊鑫(1987-)，男，博士，醫師，主要從事外周血管疾病研究。

R6

A

1005-9202(2017)05-1221-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.086