鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛星細胞體外增殖的影響

唐 芳 高品操 潘同斌

(湖南醫藥學院體育教研室，湖南 懷化 418000)

鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛星細胞體外增殖的影響

唐 芳 高品操 潘同斌1

(湖南醫藥學院體育教研室，湖南 懷化 418000)

目的 研究鈍挫傷對大鼠骨骼肌衛星細胞體外增殖的影響。方法 選取24只5周齡Wistar雄性大鼠，隨機分為安靜對照組(C組)和鈍挫傷即刻(D0組)、24 h(D24組)、48 h組(D48組)4組，每組6只。其中鈍挫傷組進行鈍挫傷的操作后，分別于即刻、24、48 h進行麻醉，與對照組一同摘取左側腓腸肌，立刻進行肌衛星細胞體外培養。另取新生鼠(N組)2只，宰殺后取下左側腓腸肌，同樣進行肌衛星細胞體外培養。結果 新生鼠骨骼肌衛星細胞增殖最顯著，在培養第2天便可見少量紡錘形的單核細胞出現；在第3天就大量增殖，當培養5 d后，衛星細胞相互融合形成多核的肌管；D0組3 d后可見肌衛星細胞，而D24、D48組4 d后可見衛星細胞，到第8天時增殖達到高峰，基本布滿大部分培養皿，部分分化融合成肌管，之后增殖速度下降。C組肌衛星細胞含量最少，且增殖速度最慢。結論 鈍挫傷對骨骼肌衛星細胞的激活與增殖具有重要作用，且新生鼠體內的肌衛星細胞并未處于靜息狀態。

骨骼肌；鈍挫傷；肌衛星細胞

挫傷后所造成肌肉組織的血腫機化、瘢痕修復嚴重影響了運動員的運動能力，骨骼肌衛星細胞一旦被激活，細胞一極或兩極發生細胞質突起和延伸，并伴隨的有絲分裂活動增多、異染色質量降低、質核比率增高和細胞內細胞器數目的增加〔1，2〕。肌衛星細胞是一種肌源性干細胞，具有一定的自我更新能力，它是成體組織內已發生某種程度定向分化的專能干細胞〔3〕。肌衛星細胞可以看作體內潛在的生肌細胞庫，當骨骼肌受到創傷或發生病理時，肌衛星細胞可以增殖、分化并遷移至受損肌組織處，彼此相互融合或與原有的肌纖維融合，形成新的肌纖維〔4〕。本文建立鈍挫傷模型，研究大鼠骨骼肌衛星細胞的體外培養情況，初步探索骨骼肌損傷修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與取材 選取24只5周齡清潔級雄性Wistar大鼠與2只新生鼠，由揚州大學比較醫學中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2007-0001。24只Wistar雄性大鼠，隨機平均分為4組。其中三組進行鈍挫傷的操作后，分別于即刻、24、48 h(D0、D24、D48組)進行麻醉，摘取左側腓腸肌，進行肌衛星細胞的體外培養。余下另一組為安靜對照組(C組)大鼠不運動，經麻醉后摘取左側腓腸肌，進行肌衛星細胞體外培養。新生鼠(N組)2只，宰殺后取下左側腓腸肌，同樣進行肌衛星細胞體外培養。

1.2 鈍挫傷模型 本實驗采用定量負荷自由落體打擊的方法制作骨骼肌鈍挫傷模型。大鼠在動物房適應性飼養3 d，3 d后用2.5%戊巴比妥鈉以2 ml/kg腹腔內注射麻醉，麻醉生效后，將左后肢褪毛，并置于伸膝、踝背屈90°、稍外展位固定，使小腿后群肌置于脛、腓骨內側，腓腸肌暴露清楚。參照陳疾忤等人〔5〕的實驗，并在此基礎上自制重物打擊裝置，為一金屬圓柱體，質量為200 g，底面面積為2.25 cm2，下降高度為36 cm，動能為0.7 J。用自制重物下砸儀從規定高處自由垂直落下打擊腓腸肌中段，以2 s的間隔連續擊打5次，造模后左后肢明顯腫脹，未見瘀血，沒有明顯的跛行，并注意保護大鼠皮膚的完整性避免感染。經解剖證實了該肌肉鈍挫傷模型建立的成功率為100%。

1.3 主要儀器與試劑 超凈工作臺(蘇州凈化工作臺)；CO2恒溫培養箱(賽默飛世爾科技)；光學倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；HH.B-TS-A1型恒溫培養箱(長沙醫療器械)；NikonE600顯微照相圖像采集系統(日本尼康)。新配置的培養基：高糖DMEM培養基(占總量的77%)、胎牛血清(占總量的10%)、馬血清(占總量的10%)、Hanks液(占總量的2%)、青-鏈霉素(占總量的1%)混合制成。

1.4 骨骼肌衛星細胞培養的分離及培養方法

1.4.1 處理組織 分別將取下的各組織在超凈工作臺中用加有2%雙抗的Hanks液清洗至無血，接著用眼科小剪刀剪成1 mm3大小的肉糜。

1.4.2 清洗組織 用Hanks液將組織清洗3遍，靜置組織沉淀并緩慢倒出洗液。加入0.25%胰蛋白酶靜置組織沉淀并倒掉液體，保留沉淀物。

1.4.3 組織消化 沉淀物中加入約5 ml的0.25%胰蛋白酶，震蕩搖勻迅速倒進離心管后塞住瓶塞，放置37℃水浴中消化60 min左右，此過程每隔10 min吹打1次，反復吹打后并出現大量乳白色懸浮絮狀物，可加入培養液停止消化。

1.4.4 過濾 將消化液在200目的過濾網中進行過濾，過濾后收集濾液置于2 000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀。

1.4.5 純化 利用肌衛星細胞與成纖維細胞貼壁速度不同，采用連續差速貼壁法純化肌衛星細胞。取沉淀放入培養瓶，加入適量培養液置于37℃，5%CO2恒溫培養箱，預貼壁30 min。差速貼壁的方式貼壁兩次，每隔1 h貼壁1次。如在CO2恒溫培養箱中取出培養瓶，緩慢倒出培養液，保留沉淀物注入新培養液，放置CO2恒溫培養箱中靜置1 h后，繼續重復注入一次新培養液進行培養。

1.4.6 細胞培養 從靜置的培養瓶中緩慢倒出培養液，保留沉淀物注入新培養液，輕微搖勻后倒入被多聚賴氨酸包被的培養皿中進行培養，以后每天換液1次，并用倒置顯微鏡觀察記錄。可以持續觀察數天并注意細菌感染培養的結果。

2 結 果

2.1 各組培養第2天的衛星細胞狀況 C組和D0、D24、D48組中未見到肌衛星細胞，N組可以看見紡錘形的肌衛星細胞。成熟大鼠的正常情況下肌衛星細胞處于靜息狀態，只有在肌肉損傷或者在病理狀態下才能被激活分化增殖，所以在早期鈍挫傷組以及正常情況下的對照組均未見肌衛星細胞。N組處于發育時期，可見肌衛星細胞并仍然保持著特異性成肌細胞的活性。見圖1。

2.2 各組培養第3天的衛星細胞狀況 N組肌衛星細胞數量明顯增多，說明新生鼠的肌衛星細胞的增殖能力要明顯強于其他組。D0組可見紡錘形的肌衛星細胞，但D24、D48組以及C組仍未見到激活的肌衛星細胞。D24組、D48組與D0組相比，肌衛星細胞還未來得及被激活，可見各組衛星細胞被激活時間以及其增殖數量具有一定差異性。見圖2。

2.3 各組培養第5天的衛星細胞狀況 N組與D0組均呈現大量紡錘形的肌衛星細胞。D24、D48組以及C組也可見一定數量的肌衛星細胞，并且數量上較前一天均明顯增多，表明肌衛星細胞培養第5天開始大量增殖。見圖3。

2.4 各組培養第8天的衛星細胞狀況 各組肌衛星細胞數量均大量增加且分布比較密集，肌管數量不斷增加，最終排列較之前成熟。其中鈍挫傷組和N組均出現了融合現象，部分并有微管的出現，說明這三組的肌衛星細胞已發生了分化。培養的第8天已進入了增殖分化高峰期，各組中肌衛星細胞的密度很大，接下來的培養中肌衛星細胞的增殖速度逐漸放緩，沒有明顯的差異。見圖4。

圖1 各組培養第2天的衛星細胞狀況(×5)

圖2 各組培養第3天的衛星細胞狀況(×5)

圖3 各組培養第5天的衛星細胞(×5)

圖4 各組培養第8天的衛星細胞狀況(×20)

3 討 論

衛星細胞是一群有骨骼肌特異性的、不同種類的干細胞和前體細胞，具有成肌潛能和自我更新能力，在出生后骨骼肌的生長、對運動的適應及損傷修復中起著重要作用〔6，7〕。本文對鈍挫傷后的骨骼肌衛星細胞進行體外培養來了解骨骼肌損傷修復的過程以及影響骨骼肌修復的相關因素，并揭示骨骼肌損傷的修復機制，為運動性肌肉損傷的康復提供參考依據。本研究顯示，鈍挫傷對骨骼肌衛星細胞的激活與增殖具有重要作用，且新生鼠體內的肌衛星細胞并未處于靜息狀態。

1 任玉衡,田得祥,史和福,等.優秀運動員的運動創傷流行病學調查〔J〕.中國運動醫學雜志,2000;19(4):377-86.

2 于新凱,晁唯偉,左 群.運動性骨骼肌損傷超微結構變化的研究進展〔J〕.解剖科學進展,2013;19(3):298-302.

3 Buckingham M,Montarras D.Skeletal muscle stem cells〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2008;18(6):330-6.

4 Adams GR.Satellite cell proliferation and skeletal muscle hypertrophy〔J〕.Appl Physiol Nutr Metab,2006;31(6):782-90.

5 陳疾忤,陳世益,李云霞,等.骨骼肌鈍挫傷后肌電檢測的應用研究〔J〕.中華物理醫學與康復雜志,2005;27(1):23-5.

6 Le Grand F,Rudnicki MA.Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2007;19(6):628-33.

7 Snijders T,Verdijk LB,Smeets JS,etal.The skeletal muscle satellite cell response to a single bout of resistance type exercise is delayed with aging in men〔J〕.Age(Dordr)，2014;36(4):9699.

〔2015-11-21修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖南醫藥學院校級科研課題(20152KB15)

潘同斌(1965-)，男，教授，碩士生導師，主要從事運動生理與康復研究。

唐 芳(1988-)，女，碩士，主要從事運動保健與瑜伽康復研究。

R873

A

1005-9202(2017)05-1091-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.023

1 揚州大學