以神經內肽酶為靶點治療阿爾茨海默病的人參皂苷有效組分篩選

彭 靜 陳 曦 王 宇 羅 亮

(樂山職業技術學院康復基礎教研室，四川 樂山 614000)

以神經內肽酶為靶點治療阿爾茨海默病的人參皂苷有效組分篩選

彭 靜 陳 曦 王 宇 羅 亮

(樂山職業技術學院康復基礎教研室，四川 樂山 614000)

目的 探討以神經內肽酶(NEP)作為靶點治療阿爾茨海默病(AD)的人參皂苷有效組分和篩選方法。方法 構建sweAPP-SK細胞株作為模型細胞；采用Western印跡及ELISA鑒定構建細胞；采用MTT檢測人參皂苷組分對SK-N-SH細胞增殖能力的影響；采用NEP肽酶試劑盒測定人參皂苷組分對NEP肽酶活性的影響；采用ELISA檢測篩選有效人參皂苷組分對sweAPP-SK細胞株的影響。結果 成功構建高表達APP的sweAPP-SK模型細胞，sweAPP-SK模型細胞Aβ40、Aβ42表達量均較未轉染細胞明顯增多，差異均具有統計學意義(P<0.05)；人參皂苷組分濃度梯度試驗結果顯示，各皂苷組分最佳作用濃度分別為皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；人參皂苷組分時間梯度試驗結果顯示，最佳作用時間為48～72 h；人參皂苷Rg1、Rg3、Rb1可明顯提高NEP活性，分別為對照組細胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%，差異均具有統計學意義(P<0.05)；sweAPP-SK模型細胞經Rg1、Rg3、Rb1作用后，細胞外Aβ40、Aβ42濃度均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 人參皂苷Rg1、Rg3 、Rb1可通過NEP做治療靶點降低sweAPP-SK細胞株Aβ40、Aβ42的分泌AD的NEP靶點治療提供依據。

神經內肽酶；阿爾茨海默病；人參皂苷

β-淀粉樣蛋白(Aβ)在海馬區的沉積是阿爾茨海默病(AD)發病的典型表現，因此，清除或降低Aβ水平是治療AD的目標之一。體內大部分Aβ通過被中性神經內肽酶(NEP)為代表的一類蛋白酶降解為小分子后從體內清除。另有研究表明，NEP活性降低與腦內Aβ水平升高及AD患者認知功能障礙相關，因此，NEP有可能成為AD治療的潛在藥物靶點〔1〕。人參皂苷(Ginsenoside)是人參中的重要活性成分，可明顯改善AD的癥狀〔2〕，但關于人參皂苷療效與NEP活性關系的研究尚少。本研究構建了模擬AD患者體內Aβ水平的sweAPP-SK細胞株作為模型細胞，將NEP作為治療靶點，篩選人參皂苷治療AD的有效成分。

1 材料和方法

1.1 材料 人參皂苷購于上海融禾醫藥有限公司；MEM培養基、胎牛血清、兔抗人APP及羊抗兔二抗購于Gibco公司；噻唑藍(MTT)、增強化學發光法(ECL)發光系、NEP酶切底物及酶抑制劑購于Sigma公司；Aβ40、Aβ42試劑盒購于IBL公司；神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購于上海賽百慷生物技術股份有限公司，質粒pcDNA3.1sweAPP由Sigma公司提供技術支持。

1.2 構建sweAPP-SK細胞株 SK-N-SH接種24孔板，長至90%以上融合，棄培養基OptiMEM沖洗，然后用OptiMEM分別稀釋pcDNA3.1sweAPP及脂質體后混合，室溫孵育，加入細胞，8 h后加完全培養基，隔天換液，3 w挑選單克隆細胞株，即為sweAPP-SK細胞株，繼續培養于MEM培養基(含10%胎牛血清和400 μg/L G418)中，長至80%以上融合傳代(1∶3)。

1.3 檢測方法 (1)MTT檢測藥物毒性：接種細胞至96孔板(104/孔)，長至60%以上后融合，加入藥物繼續培養1～3 d，終止培養前4 h每孔加0.5 mg/ml MTT終止培養，棄上清后加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，混勻，檢測吸光度(波長600 nm)。(2)Western印跡檢測sweAPP-SK細胞株表達情況：sweAPP-SK接種6孔板，培養至90%以上，融合后棄上清，RIPA裂解，提取總蛋白，測定其濃度，電泳(10%SDS-PAGE、硝酸纖維素膜、160 mA/2 h)，封閉(5%脫脂奶粉)，加一抗(室溫震蕩1 h，4℃過夜)，TBST洗滌后加二抗(室溫震蕩1 h，洗滌)，ECL試劑盒檢測。(3)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：細胞接種24孔板，長至60%以上融合，加藥，72 h收上清，分別加入Aβ40、Aβ42試劑盒，4℃孵育過夜，Washing buffer沖洗，加二抗(4℃、1 h)，Washing buffer沖洗，加顯色物(室溫、避光、0.5 h)，加終止液，測定吸光度(波長450 nm)。(4)NEP肽酶實驗：細胞接種24孔板，加藥(72 h)，棄上清，加緩沖液(SAAP-AMC、Tris-HCl、37℃、1 h)，加phosphoramidon，移至eppendorf管，加APN(20 μl、56℃、1 h)，加丙酮(800 μl)，檢測吸光度(激發波長370 nm、發射波長440 nm)；根據各自試劑盒說明繪制標準曲線，計算統計數值。

1.4 統計學方法 應用SPSS15.0軟件，符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的數據采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1 sweAPP-SK細胞株構建及鑒定 sweAPP-SK細胞株高表達APP蛋白，構建成功。見圖1。sweAPP-SK細胞株Aβ40、Aβ42表達量(298.11±15.27，98.35±8.63)均較未轉染細胞(44.23±12.46，32.14±3.08)明顯增多，分別為轉染細胞表達量的6.74倍及3.06倍(均P<0.05)。

2.2 人參皂苷組分對SK-N-SH細胞增殖能力的影響 各皂苷組分最佳作用濃度分別為皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg2 50 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L，Re 50 μmol/L；皂苷組分時間梯度實驗結果顯示，最佳作用時間為48～72 h。見表1。

表1 人參皂苷組分對SK-N-SH細胞增殖能力的 影響

與0 μmol/L比較:1)P<0.05

2.3 人參皂苷組分對NEP活性的影響 人參皂苷Rg1、Rg3 、Rb1組NEP活性分別為對照組細胞酶活性的(124±3.6)%、(131±4.1)%和(121±3.2)%(均P<0.05)。

2.4 人參皂苷組分Rg1、Rg3、Rb1對sweAPP-SK細胞株的影響 sweAPP-SK細胞株經Rg1、Rg3、Rb1作用后，培養基Aβ40、Aβ42濃度均明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 人參皂苷組分Rg1、Rg3、Rb1對sweAPP-SK 細胞株的影響

與sweAPP-SK比較：1)P<0.05

3 討 論

Bormann等〔3〕研究結果顯示，遺傳、老化等相關因素可引起腦組織內Aβ 積累，并直接導致Aβ 代謝平衡的相應改變，最終導致AD病理過程的啟動。因此，尋找和篩選能有效降低Aβ 水平的藥物或藥物成分對于AD患者的治療有重大意義。

Iwata等〔4〕研究結果顯示，NEP 基因缺陷的小鼠腦組織內Aβ 水平明顯上升，而且Aβ 水平升高的程度與NEP 的缺陷程度呈正相關；另有多項研究表明，在轉基因AD模型鼠的腦組織中NEP呈過度表達狀態，同時可見Aβ水平明顯降低，而且呈劑量依賴性〔5，6〕。研究表明，AD患者腦內容易出現Aβ 沉積，形成老年斑，外在表現為NEP mRNA及表達產物含量明顯降低，同時可見神經變性斑塊部位NEP活性明顯降低〔7〕，提示NEP 在降低腦內Aβ水平的過程中可能發揮至關重要的作用，NEP 表達及其活性的增加可以作為AD相關藥物研究及臨床治療的新靶點。因此，本研究選擇NEP 為靶點進行多項人參皂苷活性成分篩選，結果顯示，Rg1、Rg3、Rb1能夠顯著提高NEP活性。

為了模擬AD患者腦內神經元的真實改變，從而準確有效地檢測人參皂苷組分對Aβ 水平的影響，本研究利用脂質體法構建高表達sweAPP的SK-N-SH 細胞作為AD的模型細胞，并命名為swe-APP-SK 細胞。結果顯示sweAPP-SK 細胞除了能夠高表達APP以外，同時也可以使細胞外Aβ40、Aβ42水平明顯升高。然后再以高表達APP 的神經母細胞瘤細胞作為模型細胞進行ELISA 試驗，結果顯示，人參皂苷Rg1 20 μmol/L，Rg3 50 μmol/L，Rb1 50 μmol/L可以明顯降低細胞外Aβ40及Aβ42水平。目前研究結果認為，人參皂苷是人參的重要活性成分，在體內能起到神經保護作用，其中人參皂苷Rb1 是作用于神經系統的主要成分〔8〕，但其對NEP活性影響的相關研究鮮有報道。本研究發現人參皂苷Rb1 能夠明顯增強神經細胞NEP活性，明顯降低細胞外Aβ40 及Aβ42水平。人參皂苷Rg3作為人參的重要成分之一，對于其在神經系統方面的作用，尤其在AD中的作用機制及療效方面的研究甚少，本研究將人參皂苷Rg3 作用于AD模型細胞swe-APP-SK，研究結果顯示，人參皂苷Rg3 也能明顯提高神經細胞NEP的活性，同時可以有效降低細胞外Aβ40及Aβ42水平。人參皂苷Rb1同樣可以作為人參的有效成分，提高神經細胞NEP的活性、降低細胞外Aβ40及Aβ42水平。

綜上所述，本研究在成功構建AD模型細胞swe-APP-SK、篩選出最佳作用濃度和作用時間基礎上，發現人參皂苷Rg1、Rg3以及Rb1均可明顯提高神經細胞NEP活性，同時可以明顯降低細胞外Aβ40及Aβ42水平，為人參皂苷應用于AD的臨床治療提供重要依據。

1 楊玲玲，張 靜，崔云燕，等.以神經內肽酶為靶點篩選治療阿爾茨海默癥天然藥物的實驗研究〔J〕.山東大學學報：醫學版，2009；47(1)：10-4.

2 李 源，劉 穎，袁海峰，等.人參皂苷Rg1對阿爾茨海默病模型大鼠腦片磷酸化Tau蛋白及膽堿乙酰基轉移酶表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(6)：1640-1.

3 Bormann H，Melzig MF.Inhibition of metallopeptidases by flavonoids and related compounds〔J〕.Pharmazie，2000；55(2)：129-32.

4 Iwata N，Tsubuki S，Takaki Y，etal.Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin〔J〕.Science，2001；292(5521)：1550-2.

5 Marr RA，Guan H，Rockenstein E，etal.Neprily sin regulates amyloid Beta peptide levels〔J〕.J Mol Neurosci，2004；22(1-2)：5-11.

6 Mohajeri MH，Kuehnle K，Li H，etal.Anti-amyloid activity of neprilysin in plaque-bearing mouse models of Alzheimer′s disease〔J〕.FEBS Lett，2004；562(1-3)：16-21.

7 Iwata N，Takaki Y，Fukami S，etal.Region-specific reduction of a beta-degrading endopeptidase，neprilysin，in mouse hippocampus upon aging〔J〕.J Neurosci Res，2002；70(3)：493-500.

8 沈思鈺，干振華，傅曉東，等.人參皂苷對神經系統作用的研究現狀及分析〔J〕.安徽中醫學院學報，2004；23(1)：62-4.

〔2016-04-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

樂山市科技局重點研究項目(No.15ZDYJ0150)

陳 曦(1983-)，女，主治中醫師，主要從事老年疾病康復研究。

彭 靜(1983-)，女，講師，主治中醫師，碩士，主要從事針灸康復治療老年性疾病研究。

R331

A

1005-9202(2017)05-1089-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.022

1 樂山市市中區人民醫院康復科

2 樂山市中醫醫院針灸康復科