雌激素預防切除卵巢大鼠顱內動脈瘤破裂的效果及機制

李 濤 李秀山 計彥新 葛 虹 王紅斌

(河北工程大學附屬醫院神經外二科，河北 邯鄲 056002)

雌激素預防切除卵巢大鼠顱內動脈瘤破裂的效果及機制

李 濤 李秀山 計彥新1葛 虹2王紅斌3

(河北工程大學附屬醫院神經外二科，河北 邯鄲 056002)

目的 探討雌激素預防切除卵巢大鼠顱內動脈瘤破裂的效果及作用機制。方法 140只雌性Wistar大鼠隨機分為賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、一氧化氮(NO)合成抑制劑N-亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組，每組20只，均進行切除雙側卵巢+制作動脈瘤模型。醋酸去氧皮質酮(DOCA)-鹽型誘導顱內動脈瘤小鼠形成的模型，各組分別于DOCA注射后第6天給予賦形劑二甲基亞砜(DMSO)、17-β-雌二醇、17-β-雌二醇聯合ER拮抗劑、ER-α亞型激動劑(PPT)、ER-β亞型激動劑(DPN)、L-NAME、DPN聯合L-NAME，大鼠出現動脈瘤破裂癥狀時處死，或給藥持續至DOCA注射后第21天時處死。統計分析各組動脈瘤形成情況以及破裂的動脈瘤發生率和動脈瘤破裂率。結果 雌激素治療組破裂的動脈瘤發生率及動脈瘤破裂率顯著低于賦形劑組和雌激素+ER拮抗劑組，ER-β受體激動劑組顯著低于賦形劑組(P<0.05)，ER-α受體激動劑組與賦形劑組比較無顯著差異(P>0.05)。與賦形劑組比較，L-NAME組破裂的動脈瘤發生率及動脈瘤破裂率無統計學差異(P>0.05)，ER-β受體激動劑+L-NAME組顯著高于ER-β受體激動劑組(P<0.05)。結論 雌激素能夠預防切除卵巢大鼠顱內動脈瘤破裂，可能與雌激素刺激ER-β受體激活有關，且這種作用依賴于NO的產生。

雌激素；絕經；顱內動脈瘤破裂

研究表明雌激素可能具有潛在的保護作用，預防絕經后婦女動脈瘤破裂〔1，2〕。已經有動物實驗表明，雌激素能夠預防動脈瘤的形成〔3〕。然而，目前尚沒有實驗研究發現雌激素對動脈瘤破裂是否具有預防作用。本研究評估了雌激素和非選擇性雌激素受體(ER)抑制劑對切除卵巢的雌性大鼠動脈瘤破裂的影響，其中切除卵巢的雌性老鼠用于模擬絕經后婦女的狀況。本研究參考相關文獻〔4～6〕，使用一個概括了人類顱內動脈瘤主要特點(包括自發破裂)的顱內動脈瘤大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 140只SPF級雌性Wistar大鼠，均購自南方醫科大學實驗動物中心，生產許可證號SCXK粵2006-0015，8～10周齡，體質量(220±20)g。隨機分為賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、一氧化氮(NO)合成抑制劑N-亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組，每組20只，均進行切除雙側卵巢+制作動脈瘤模型。具體方法：稱重，3.6%的水合氯醛麻醉，麻醉生效后剪去腹部和腿部鼠毛，并固定于手術臺，取下腹正中切口充分暴露膀胱，沿膀胱旁邊脂肪中的子宮找到一側卵巢，結扎切除雙側卵巢，制作去卵巢大鼠模型。止血后關閉腹腔并常規消毒。下一步進行醋酸去氧皮質酮(DOCA)-鹽型大鼠模型建立，取脊柱左側、第12肋下緣切口充分暴露左腎，結扎腎靜、動脈，切除左側腎臟，逐層縫合并常規消毒。大鼠自然蘇醒后常規飼養1 w，但飲用1%的生理鹽水。術后1 w給予5 mg DOCA溶液皮下注射，2次/w，按照周一、周五間隔給藥，連續給藥3 w共21 d，自由攝食，飲用1%的生理鹽水。

1.2 給藥方法 參考相關文獻〔5〕，各組于DOCA注射后第6天給藥，賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、L-NAME治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組分別給予賦形劑二甲基亞砜(DMSO)0.17 mg/kg、17-β-雌二醇0.17 mg/kg、17-β-雌二醇(0.17 mg/kg)聯合ER拮抗劑(3 mg/kg)、ER-α亞型激動劑(PPT)0.17 mg/kg、ER-β亞型激動劑(DPN)0.17 mg/kg、L-NAME 1 mg/kg、DPN(0.17 mg/kg)聯合L-NAME(1 mg/kg)，1次/d。相關試劑均購自上海亨代勞生物有限公司，給藥劑量均參照過往文獻〔7〕。給藥持續至DOCA注射后第21天或處死時。

1.3 動脈瘤破裂和動脈瘤判斷標準 出現以下任何癥狀之一即可判斷為動脈瘤破裂〔5〕：①體重減輕(體重減少超過10%且持續24 h)，飲食和飲水明顯減少；②軀干彎曲，前肢抬起；③以正常的姿勢沿一邊繞行；④休息時傾倒在一邊；⑤沒有自發性的活動。各組出現上述癥狀后處死，記錄處死時的時間，其余未出現癥狀的于DOCA注射后第21天處死。取同載瘤動脈大腦樣本，磷酸鹽緩沖鹽水灌注，然后灌注包含藍色染料的明膠顯現腦動脈，動脈瘤被定義為局部向外膨脹的血管壁直徑大于主動脈直徑。

1.4 統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗；繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗進行生存分析。

2 結 果

2.1 造模一般情況 造模過程中賦形劑組、雌激素治療組、雌激素+ER受體拮抗劑治療組、ER-α受體激動劑治療組、ER-β受體激動劑治療組、L-NAME治療組、ER-β受體激動劑治療+L-NAME治療組分別有1只、3只、3只、8只、5只、5只、4只大鼠死亡。

2.2 雌激素對去卵巢大鼠動脈瘤破裂的影響 賦形劑組、雌激素治療組以及雌激素+ER拮抗劑組顱內動脈瘤發生率無統計學意義(73.68% vs 76.47% vs 82.35%，P>0.05)，說明雌激素以及雌激素+拮抗劑治療并未影響顱內動脈瘤發生率；雌激素治療組破裂的動脈瘤發生率(17.65%)以及動脈瘤破裂率(23.08%)顯著低于賦形劑組(63.16%、85.71%)和雌激素+ER拮抗劑組(58.82%、71.43%)(P<0.05)；通過繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗發現，在排除未發生動脈瘤的大鼠之后，雌激素治療組動脈瘤破裂率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

與賦形劑組比較：1)P<0.05；與雌激素+ER拮抗劑組比較：2)P<0.05；同下圖 圖1 雌激素預防去卵巢大鼠動脈瘤破裂

2.3 雌激素預防去卵巢大鼠動脈瘤破裂作用的受體亞型 賦形劑組、ER-α以及ER-β受體激動劑組顱內動脈瘤發生率無統計學意義(73.68% vs 66.67% vs73.33%，P>0.05)；ER-β受體激動劑組破裂的動脈瘤發生率(13.33%)以及動脈瘤破裂率(18.18%)顯著低于賦形劑組(63.16%、85.71%，P<0.05)；通過繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗發現，在排除未發生動脈瘤的大鼠之后，ER-β受體激動劑組動脈瘤破裂率顯著降低(P<0.05)。而ER-α受體激動劑組(50.00%、75.00%)與賦形劑組(63.16%、85.71%)破裂的動脈瘤發生率以及動脈瘤破裂率均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 雌激素刺激ER-β預防去卵巢大鼠動脈瘤破裂

2.4 雌激素刺激ER-β依賴于NO的產生 與賦形劑組比較，L-NAME組破裂的動脈瘤發生率(53.33%)及動脈瘤破裂率(61.54%)均無統計學差異(P>0.05)；ER-β受體激動劑+L-NAME組(68.75%，78.57%)顯著高于ER-β受體激動劑組(13.33%、18.18%)(P<0.05)。見圖3。

與賦形劑組比較：1)P<0.05；與ER-β受體激動劑+L-NAME組比較：2)P<0.05 圖3 雌激素刺激ER-β依賴于NO的產生

3 討 論

本研究結果表明，雌激素能夠預防切除卵巢的雌性大鼠動脈瘤破裂，與流行病學研究結果相符合〔1〕。ER-β在人腦動脈和顱內動脈瘤中呈陽性表達，而雌激素的這種預防作用可能與刺激ER-β激活有關。此外，雌激素刺激ER-β保護顱內動脈瘤預防破裂還依賴于NO的產生。本文結果認為雌激素通過刺激ER-β預防顱內動脈瘤破裂。

在切除卵巢的雌性大鼠(即絕經后大鼠)中，發現雌激素刺激ER-β激活保護顱內動脈瘤破裂的作用依賴于NO的產生。與本研究結果類似，諸多研究均表明雌激素的心血管保護效應是由ER-β以NO依賴方式介導的〔8，9〕。ER-β激活不僅可以刺激誘導內皮NO合成酶的表達，同時也能增加NO的生成〔10〕。顱內動脈瘤的病理生理與急、慢性炎癥密不可分，而內皮NO合成酶和NO參與了急、慢性炎癥的發生和發展〔11〕。NO對各種蛋白質巰基亞硝基化可以防止半胱氨酸殘基的氧化修飾，可能減少過度的組織重構，從而降低動脈瘤破裂風險〔9〕。本研究仍然存在一定的局限性：NO合成酶有多種類型，目前尚不清楚哪種類型的NO合成酶能夠應答ER-β發揮保護作用，也不清楚是哪種蛋白質巰基亞硝基化。在以后的實驗中將利用特定亞型硝酸氧化氮合酶抑制劑以及特定亞型的NO合成酶基因敲除小鼠進一步深入研究。

本研究中另外一個局限性在于使用了8～10 w相對年輕的大鼠。雌性大鼠約在7 w左右進入生殖期，在12～14個月左右進入更年期。多數研究評估雌激素對絕經期的作用均選擇8～10周齡卵巢切除的雌性大鼠〔12〕。然而，相對年輕的絕經前卵巢切除大鼠可能并不能完全模擬出正常年長大鼠的更年期生理〔13〕。卵巢切除可導致卵巢激素的突然損失并繞過以雌激素的逐漸損失和波動為特征的圍絕經期〔13〕。由于年齡相關的各組織和應答的變化，在生育年齡早期階段和晚期階段，卵巢切除和雌激素治療的效果可能不同〔13〕。此外，在絕經早期和晚期階段，ER的表達水平、靈敏度以及應答也存在差異〔14〕。更年期會引起雌激素和孕激素缺失，孕激素可以通過調節炎癥和氧化應激改善缺血性和創傷性腦損傷動物預后，在神經保護作用方面，孕激素和雌激素可能存在一定的相互作用；此外，睪酮能夠激活促炎癥因子或調節氧化應激增加炎癥反應〔15〕。大腦血管炎癥可能受雌激素、睪酮、孕激素之間平衡的影響。

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〔2016-07-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目(No.1523108076-2)

王紅斌(1970-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管病、顱底外科、腦腫瘤等研究。

李 濤(1978-)，男，主治醫師，主要從事出血性腦血管病的介入治療研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)05-1081-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.019

1 邢臺市中醫院康復科 2 邯鄲市第一醫院護理部

3 河北工程大學附屬醫院神經外科