自擬組方補腎固筋方對膝骨性關(guān)節(jié)炎兔血清及關(guān)節(jié)液白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α的影響

王恒樹 張 沖

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011)

自擬組方補腎固筋方對膝骨性關(guān)節(jié)炎兔血清及關(guān)節(jié)液白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α的影響

王恒樹 張 沖1

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011)

目的 觀察自擬組方補腎固筋方對膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)兔血清及關(guān)節(jié)滑液白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達及調(diào)節(jié)機制。方法 選取9個月齡健康雄性新西蘭大白兔44只，隨機盲法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組11只，除正常組外均采用改良Hulth造模法造模成功后連續(xù)給藥12 w，取空腹血清及造模膝關(guān)節(jié)前方部分滑膜組織、股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨及軟骨下骨及滑液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測血清及關(guān)節(jié)滑液IL-1、TNF-α的含量及變化。結(jié)果 肉眼觀察西藥組關(guān)節(jié)間隙狹窄程度介于模型組和中藥組之間，關(guān)節(jié)表面粗糙，軟骨下骨贅生成明顯；中藥組關(guān)節(jié)間隙較其他各組稍窄，關(guān)節(jié)表面觸之稍粗糙伴輕微骨贅生成；中藥組光鏡下見軟骨細胞大小均勻排列整齊，模型組軟骨細胞大小不均且呈簇狀排列；模型組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。兩個給藥組與模型組比較血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，兩給藥組之間無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 補腎固筋方可以明顯降低血清和關(guān)節(jié)滑液IL-1、TNF-α的分泌水平。

補腎固筋方；兔膝骨性關(guān)節(jié)炎；美洛昔康；軟骨細胞；白細胞介素-1；腫瘤壞死因子-α

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)以關(guān)節(jié)軟骨變性及骨質(zhì)增生為病理特征。《素問·痹論》：痹之安生？岐伯對曰：風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也〔1〕，治療多用非甾體類藥物或脛骨高位截骨、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)〔2〕。中藥熟地、枸杞、杜仲、穿牛膝等治療KOA療效確切〔3〕。本實驗研究補腎固筋方對KOA兔血清及關(guān)節(jié)液白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 44只SPF級雄性9個月齡新西蘭大白兔體重2.5～3.0 kg，實驗于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心設(shè)施內(nèi)進行〔動物質(zhì)量合格證號：scxk(冀)2012-1-004〕，處死動物前經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會同意。適應(yīng)環(huán)境后喂養(yǎng)3 w，室溫15℃～25℃，相對濕度45%～60%，每天正常光照，空氣流通，標準飼料(組成：麥麩、玉米、大白菜、芹菜)喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 藥物 補腎固筋方組成：熟地20 g、補骨脂20 g、枸杞子20 g、巴戟天15 g、川牛膝18 g、丹參15 g、木瓜10 g、雞血藤15 g，根據(jù)進食欠佳，精神倦怠，喜暖惡寒，活動多少等按中醫(yī)辨證加減治療，風(fēng)寒濕痹加減防風(fēng)、黃芪、羌活、獨活、桂枝；風(fēng)濕熱痹加減秦艽、羌活、茯苓、石膏；瘀血閉阻證加減桃仁、紅花、地龍；肝腎虧虛證偏于陰虛者加減枸杞子、山茱萸、川牛膝；偏于陽虛者加減菟絲子、制附子、肉桂；以上藥量為成人藥量。購于河北省中醫(yī)院藥房，河北省中醫(yī)院制劑室常規(guī)煎煮取汁300 ml，藥液濃縮加入蒸餾水后配成6 g/ml；美洛昔康膠囊，7.5 mg，四川寶光藥業(yè)股份有限公司，國藥準字:H20010209批次號：12050277 0265，加入蒸餾水配制成0.5 mg/ml溶液；注射用青霉素G鈉(石家莊制藥集團有限公司,160 萬IU/支，批號：A091136207)；2%利多卡因河北醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室制備。

1.3 試劑及儀器 兔IL-1、TNF-α ELISA試劑盒(IL-1 ELISA Kit Human，TNF-α ELISA Kit，規(guī)格：48T/96T)、免疫吸附劑、標記物和顯色劑；酶聯(lián)免疫檢測儀(規(guī)格：Bio-565)、DNM-9602A酶標分析儀(規(guī)格：DNM-9602A)、微量注射器(針頭：33G)、移液器均購自上海酶聯(lián)生化試劑有限公司；德國干燥箱(型號：TG100，產(chǎn)地：Hahn,Dusseldorf,Germany，廠家：Germany RETSCH Company)；恒溫水箱(DDIL-5型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；石蠟切片機(u-641型，美國貝克曼公司)；光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)(BH-5型，日本Olympus公司)；全自動圖像分析系統(tǒng)(Huu-12A型，日本日立公司)；723分光光度計(ELX8086型，美國寶特公司)；數(shù)碼X線機(CEx86型，美國GE公司)；4%多聚甲醛(山東省壽光市旭東化工有限公司，CAS號：30525-89-4)；滅菌注射用水(5 ml，石家莊第四制藥有限公司)。

1.4 動物分組及模型制備 44只新西蘭大白兔隨機分為正常組、模型組、西藥組及中藥組各11只,觀察和造模過程后2～3 w內(nèi)各組均死亡了1只后每組各10只。除正常組外均采用改良Hulth造模〔4〕。2%利多卡因(30 mg/kg)后肢靜脈麻醉，常規(guī)消毒取血，右后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)縱切口長約5 cm，逐層切開、分離，探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后，完整切除內(nèi)側(cè)半月板、前交叉韌帶(ACL)，內(nèi)側(cè)副韌帶(MCL)，造成負重力線內(nèi)移及膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。術(shù)側(cè)肢體不固定，術(shù)后肌注青霉素160萬IU·kg-1·d-1，連續(xù)8 d，每隔1 d觀察創(chuàng)口愈合情況，預(yù)防感染。術(shù)后第4天即強迫兔奔跑(0.5 h/d)，活動范圍約2 h/d。造模2 w后軟骨出現(xiàn)改變，6 w后進入平臺期，10 w后開始出現(xiàn)典型的晚期OA改變。當(dāng)脛股關(guān)節(jié)面正常外翻10°變?yōu)閮?nèi)翻，X線片顯示下肢力線改變且跛行明顯，前抽屜實驗和內(nèi)側(cè)應(yīng)力實驗陽性即表示造模成功。本實驗造模成功率為81.3%。

1.5 干預(yù)方法 造模成功3 w后干預(yù)治療，采用人與動物的體表面積計算法換算：兔藥量(2.5 kg)/d=成人(65 kg)藥量/d×0.07×2.5×2/3，美洛昔康藥量為6 mg·kg-1·d-1，補腎固筋方藥量為53 g·kg-1·d-1，每天兩次鼻飼胃管注射；正常組、模型組灌胃15 ml生理鹽水，2次/d，連續(xù)干預(yù)8 w。

1.6 觀察指標

1.6.1 步態(tài) 采用Coderre法〔5〕步態(tài)分級評價。0 級：正常步態(tài)，行走時間>5 min；Ⅰ級：輕度跛行，行走時間3～5 min；Ⅱ級：中度跛行，行走時間<3 min。

1.6.2 X線檢查 處死動物前拍攝兔膝關(guān)節(jié)正位和側(cè)位DR片。X線損傷情況按改良David等〔6〕分級，0度：正常；Ⅰ度：可疑；Ⅱ度：肯定；Ⅲ度：明顯退變或伴骨質(zhì)增生。

1.6.3 關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué) 耳緣靜脈空氣栓塞處死，1 ml生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，取脛骨內(nèi)側(cè)軟骨面并肉眼觀察變化，取膝關(guān)節(jié)前方滑膜組織和股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，剪成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊1 min內(nèi)置于10%中性緩沖甲醛溶液中固定24 h。水沖洗1 h，5%甲酸甲醛脫鈣2 w；75%、85%、95%、100%各種濃度乙醇進行逐級脫水；石蠟包埋切片(5 μm)。70℃烤箱內(nèi)烤片30 min后HE染色，觀察關(guān)節(jié)軟骨的層次、軟骨細胞及軟骨下骨變化。

1.6.4 血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α檢測 取實驗結(jié)束造模后藥物干預(yù)8 w空腹處死動物后，立即心臟取血5 ml，3 000 r/min離心10 min分離出血清及關(guān)節(jié)滑液-60℃冰凍保存；5 000 r/min分離出關(guān)節(jié)軟骨及滑液后，-80℃超低溫冰箱保存24 h后再放入液氮(-196℃)保存。采用ELISA檢測兔血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件行ANOVA及q檢驗。

2 結(jié) 果

圖1 各組骨形態(tài)學(xué)結(jié)果(HE，×40)

2.1 肉眼及鏡下觀察 見圖1。正常組關(guān)節(jié)軟骨藍白色且色澤透明軟骨表面光滑觸之較硬，關(guān)節(jié)液量少；模型組滑膜腫脹明顯，軟骨表面不光滑，關(guān)節(jié)邊緣與滑膜有少許纖維性粘連凹凸不平，鏡下見關(guān)節(jié)軟骨細胞大小不均呈深層簇聚排列；兩個給藥組關(guān)節(jié)軟骨呈白色觸之欠光滑，滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液較正常組稍多，輕度滑膜炎性改變，鏡下西藥組軟骨細胞排列欠完整，簇狀增生；中藥組軟骨細胞排列完整，相對整齊。

2.2 X線影像學(xué)比較 正常組兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙均勻一致，關(guān)節(jié)面平整，邊緣整齊規(guī)則無骨贅，關(guān)節(jié)內(nèi)無游離體；模型組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄外側(cè)間隙增大，骨囊變、骨贅形成；中藥組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙狹窄不明顯，未見明顯骨贅形成；西藥組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙介于模型組和中藥組之間，有輕微骨贅形成。

2.3 IL-1、TNF-α檢測 模型組血清及關(guān)節(jié)液與正常組相比IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。兩個給藥組與模型組相比血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，與正常組相比含量明顯降低(P<0.01)，兩給藥組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量 比較

與模型組比較:1)P<0.01

3 討 論

KOA的病理機制是關(guān)節(jié)軟骨退變，變性退變的關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，龜裂缺損的范圍及深度各有差異〔7〕。研究表明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和骨性關(guān)節(jié)炎(OA)中均可檢測到IL-1的存在；IL-1可促進慢性滑膜炎進一步加重，同時軟骨基質(zhì)降解產(chǎn)物也可刺激滑膜繼發(fā)炎癥形成惡性循環(huán)〔8〕，IL-1還可促進軟骨細胞分泌前列腺素(PGE)2〔9〕，刺激骨吸收及成骨細胞增生鈣化，軟骨下骨異常增生形成骨贅〔10〕。OA軟骨免疫組化染色的基質(zhì)及細胞中TNF-α及其受體均呈現(xiàn)陽性，這種陽性強度與范圍和OA嚴重程度呈正比〔11〕；TNF-α促進多形核細胞刺激滑膜細胞PGE2分泌，進而破壞骨軟骨，TNF-α可以加速滑膜成纖維細胞樣細胞增殖，導(dǎo)致最終滑膜組織纖維素樣變性，同時IL-1、TNF-α協(xié)同作用加快了膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解〔12〕。

筆者積累多年臨床經(jīng)驗參考大量文獻自擬補腎固筋方，治則補益肝腎，強筋健骨，以熟地、補骨脂為君藥，熟地性微溫、味甘，滋陰養(yǎng)血，補骨脂乃補腎壯陽益精填髓之要藥，熟地、補骨脂和枸杞子配伍可以改善微循環(huán)與血液流變學(xué)，通過降低骨內(nèi)壓來緩解骨和骨髓血流動力學(xué)及其引起的代謝異常〔13〕，更有利于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)；臣藥巴戟天、川牛膝和雞血藤改善軟骨細胞功能，促進軟骨細胞合成，刺激軟骨生發(fā)區(qū)產(chǎn)生大量幼稚軟骨〔14〕，減少或阻斷因關(guān)節(jié)軟骨片丟失引起的滑膜分泌〔15〕；木瓜、丹參是活血化瘀藥可以促進關(guān)節(jié)內(nèi)外的血液循環(huán)，改善靜脈瘀滯狀態(tài)，加速血液回流〔16〕。本研究證明補腎固筋方可以有效抑制滑膜炎性改變，減少炎性物質(zhì)對軟骨和滑膜的侵害；同時增強滑膜的滲透作用和關(guān)節(jié)軟骨細胞代償能力，對軟骨皸裂、退變和破壞起到一定的延緩作用；補腎固筋方還通過抑制IL-1、TNF-α的分泌來改善滑膜液性反應(yīng)，修復(fù)并延緩軟骨退變、促進軟骨修復(fù)。本研究雖提供了一定的實驗資料闡述了中藥復(fù)方治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機制，但仍有不足還需從分子生物學(xué)角度進一步探討PGE2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及IL-1之間的相互協(xié)同作用。

1 國家中醫(yī)藥管理局.中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準·中醫(yī)病證診斷療效標準〔M〕.南京：南京大學(xué)出版社，1999：49-71.

2 Fitzgerald GK,White DK,Piva SR.Associations for change in physical and psychological factors and treatment response following exercise in knee osteoarthritis:an exploratory study〔J〕.Arthrit Care Res,2012;64(2):1673-80.

3 崔向?qū)?李玉波,李 妍,等.活血、利水中藥對腦出血大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α、核轉(zhuǎn)錄因子-KB及水通道蛋白-4表達的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合,2012;2(17):513-5.

4 Hulth A,Lindberg L,Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits〔J〕.Acta Orthop Scand,1970;41(5):522-30.

5 Coderre D,Le Marechal H，Ekindjian OG,etal.Nitric oxide modifies glycolytic pathways in cultured human synoviocytes〔J〕.Cell Biol Int,2008;2(5):285-6.

6 David T,Atkins CM,Allen MT,etal.Inhibition of nitric oxide synthesis impairs two different forms of learning〔J〕.Neuro Report,2012;3(7):567-70.

7 Wood H,Geroganas C,Pagliari LI,etal.Bcl-2 expression in synovial fibroblast is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability〔J〕.J Immunol,2000；164(10):5227-35.

8 Parmelee PA,Harralson TL,McPherron JA,etal.The structure of affective symptomatology in older adults with osteoarthritis〔J〕.Int J Geriatr Psychiatry，2013；28(4):393-401.

9 Venkataramanan V,Gignac MA,Dunbar M,etal.The importance of perceived helplessness and emotional health in understanding the relationship among pain,function and satisfaction following revision knee replacement surgery〔J〕.Osteoarthr Cartil,2013;21(7):911-7.

10 Racine J,Aaron RK.Pathogenesis and epidemiology of osteoarthritis〔J〕.R I Med J(2013),2013;96(3):19-22.

11 李 旭，王海立，朱 煉，等.單側(cè)髕骨粉碎性骨折行髕骨完全切除后對雙側(cè)膝關(guān)節(jié)遠期功能的影響〔J〕.中華創(chuàng)傷骨科雜志,2013;11(15):928-31.

12 任紅革,崔逢德.細胞因子在骨性關(guān)節(jié)炎中的表達與應(yīng)用〔J〕.中國組織工程研究,2012;16(52):9828-35.

13 傅 濤,徐永華.細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進展〔J〕.細胞生物學(xué)雜志,2012;8(4):153-5.

14 季衛(wèi)鋒.補腎活血法防治大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究〔J〕.中國骨傷,2012;28(3):246-50.

15 許 峰,章光華,李歡華.蠲僂丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥37例〔J〕.中醫(yī)雜志,2010;12(3):117-8.

16 李 麗,邱全瑛,吳王君,等.化瘀蠲痹止痛顆粒對DTH小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,1999;22(5):67-70.

〔2015-10-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省中醫(yī)藥管理局指導(dǎo)性課題(No.2014172；No.2015107)

張 沖(1976-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨科、微創(chuàng)骨科臨床科研及教學(xué)研究。

王恒樹(1975-)，男，碩士，副主任技師，主要從事骨科病因病理學(xué)研究。

R274.3

A

1005-9202(2017)05-1079-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.018

1 河北省中醫(yī)院