Notch1信號通路在膠質瘤中的作用機制

黃春波 張豪杰 楊瑞生 李慶安 王偉豐 靳曉亮 李同寬 霍宇飛 馬燕然 胡金江

(濟源市人民醫院神經外科，河南 濟源 459000)

Notch1信號通路在膠質瘤中的作用機制

黃春波 張豪杰1楊瑞生 李慶安 王偉豐 靳曉亮 李同寬 霍宇飛 馬燕然 胡金江

(濟源市人民醫院神經外科，河南 濟源 459000)

目的 探討Notch1信號通路在人腦膠質瘤中的作用機制。方法 應用實時熒光量(real-time)PCR方法檢測 50 例人腦膠質瘤標本和10例正常腦組織中的 Notch1及其下游靶基因Hes1以及增殖指標Ki-67及PCNA的 mRNA 表達。利用Western印跡檢測Notch1的活化片段NICD的表達。結果 Notch1 mRNA 在人腦膠質瘤和正常腦組織中均可表達，但在人腦膠質瘤中的表達顯著高于正常腦組織(P<0.01)，隨著膠質瘤惡性程度的增高，Notch1及其下游靶基因Hes1的表達也隨之升高，兩者的變化趨勢一致。Ki-67在膠質瘤中的表達升高，與正常腦組織對比差異顯著(P<0.01)；PCNA在人腦膠質瘤中的表達同樣升高，與正常腦組織對比差異顯著(P<0.05)。結論 Notch1信號通路可能通過Hes1作用于膠質瘤細胞，促進細胞的增殖，進而參與到腫瘤的形成及惡化。

Notch1信號通路；人腦膠質瘤

腦膠質瘤作為中樞神經系統最常見的、預后很差的原發性惡性腫瘤，手術聯合放、化療的綜合治療后的膠質瘤病人極易復發，且容易產生對放化療作用的抵抗。因此尋找更為有效的治療方法至關重要。Notch1信號通路在正常組織中，可以參與細胞的增殖、轉移，調節組織的修復，其受體在正常組織中廣泛分布，可參與胚胎的發育、組織的生成〔1〕。在膠質瘤和髓母細胞瘤中Notch1信號通路異常激活。異常激活的Notch1信號通路促進惡性膠質瘤干細胞的細胞分化和血管化，促進膠質細胞惡化并通過促進血管化加速腫瘤的侵襲和轉移〔2〕。Zhang等〔3〕研究發現Notch1信號通路可能參與膠質瘤細胞的侵襲和轉移。臨床流行病學發現Notch1可以作為膠質瘤的一個標志物分子〔4〕，在膠質瘤篩查中具有一定的作用。但是對于具體的Notch1信號通路在膠質瘤侵襲轉移中的具體分子機制目前尚不清楚。本研究通過基因及蛋白水平檢測 Notch1及其下游靶基因Hes1，在各級別人腦膠質瘤和正常腦組織的表達情況，分析其與膠質瘤病理級別的相關性，探討Notch1在人腦膠質瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集濟源市人民醫院2012年2月至2015年9月手術切除的人腦膠質瘤新鮮標本50例，男 29 例，女 21 例，年齡 22～65歲，中位年齡43.5歲 。按2000年WHO腦腫瘤分類標準：Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質瘤)28 例； Ⅲ～Ⅳ級(高度惡性膠質瘤)22例。所有標本均為首次確診，手術前未經任何化療、放療及其他免疫抑制治療。通過內減壓手術獲得新鮮正常腦組織標本 10 例作為對照 。所有標本均凍存在-80℃冰箱內。主要試劑：Trizol購自美國Ambion公司；M-MLV逆轉錄試劑盒購自Invitrogen中國公司； 實時熒光定量PCR(real-time PCR)中的熒光染料iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix購自美國BIO-RAD公司；Western印跡檢測所有蛋白抗體Notch1抗體及β-actin抗體均購自英國Abcam公司；蛋白二抗購自北京中山金橋公司；Notch1、Hes1級ki-67擴增引物均由Invitrogen公司合成。引物序列：ki-67上游引物：5′-GCACTCTCCGCTCAGTAAGTC-3′，下游引物：5′-GGCCTGATGTTTGGAAGACC-3′;PCNA上游引物：5′-GGCAGAGGGTTGGTAGATGT-3′,下游引物：5′-ACAAACATGGTGGCGGTGTT-3′；Notch1上游引物：5′-TTCGTGCTCCTGTTCTTTGTC-3′,下游引物：5′-GGGCTCTCTCCGCTTCTTG-3′；Hes1：上游引物：5′-CGACACCGGACAAACCAAT-3′，下游引物：5′-GAATGTCTGCCTTCTCCAGCTA-3′;β-actin：上游引物：5′-ATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR檢測腦膠質瘤中Notch1、Hes1及ki-67基因表達水平 取-80℃凍存的組織，用TRIzol試劑提取RNA，M-MLV逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，再用real-time PCR法檢測Notch1、Hes1及ki-67的mRNA相對水平變化。

1.2.2 Western印跡檢測組織中Notch1蛋白表達水平 取-80℃凍存的組織50 mg，研磨成細胞勻漿，加入組織裂解液500 μl和多種蛋白酶抑制劑混合液(cocktail)5 μl，冰浴；4℃ 12 000 r/min，離心10 min后取上清，采用Bradford法測定樣品蛋白質的濃度。按照每泳道100 μg加樣進行100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，將蛋白質條帶轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)；用含50 g/L脫脂奶粉的PBST(PBS+0.1%Tween-20)溶液封閉2 h后，加入Notch1抗體(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000)一抗，4℃過夜；用PBST溶液洗膜3次，10 min/次。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)-labeled(1∶20 000)二抗，室溫避光孵育1 h，再用PBST溶液洗膜3次，10 min/次，然后用增強化學發光法(ECL)發光底物顯影、定影、拍照。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組Notch1及Hes1 mRNA的表達水平 膠質瘤組中Notch1 mRNA水平(1.89±0.18)、Hes1 mRNA水平(1.44±0.15)均高于正常對照組(均為1)(均P<0.01)；且隨著膠質瘤惡性程度的增高，Notch1及Hes1 mRNA水平也逐漸升高。Hes1的變化水平同Notch1一致。其中Ⅰ～Ⅱ級Notch1及Hes1 mRNA為1.68±0.28，1.29±0.16，Ⅲ～Ⅳ級為2.10±0.39，1.65±0.07。

2.2 兩組ki-67及增殖細胞核抗原(PCNA)的mRNA水平比較 ki-67在膠質瘤組中表達(3.43±0.20)高于正常對照組(1)(P<0.05)。隨著膠質瘤惡性程度的升高，ki-67的mRNA表達也逐漸升高(Ⅰ～Ⅱ級：2.84±0.13，Ⅲ～Ⅳ：4.01±0.91)。PCNA在人腦膠質瘤組中表達(2.19±0.54)高于正常對照組(1)(P<0.05)，且隨著膠質瘤惡性程度的升高而升高(Ⅰ～Ⅱ級：2.01±0.72，Ⅲ～Ⅳ級：2.37±0.39)。

2.3 兩組Notch1的蛋白水平比較 Western印跡結果同real-time PCR結果一致，膠質瘤組Notch1的活化片段NICD水平較正常腦組織組高，隨著膠質瘤惡性程度的增高，NICD的表達增高。見圖1。

1：正常腦組織2：Ⅰ級膠質瘤3：Ⅱ級膠質瘤4：Ⅲ級膠質瘤5：Ⅳ級膠質瘤 圖1 兩組Notch1活化片段NICD的變化水平

3 討 論

膠質瘤死亡率較高，在國內顱內腫瘤中占44.69%〔5〕。膠質瘤主要分為星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤和多形膠質母細胞瘤〔6〕。星形細胞瘤最常見。膠質母細胞瘤(Ⅳ級)有最高程度的惡性腫瘤和侵襲能力，占腦腫瘤的50%～60%〔7〕。多種癌基因和抑癌基因異常與膠質瘤的發生有關 。而腫瘤的生長、轉移和預后均與腫瘤細胞的增殖相關。有研究顯示Notch1信號通路可以參與到腫瘤細胞的增殖，而ki-67及PCNA是一種與增殖細胞相關的核抗原,是近年來認為更能有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要標志物〔8〕。

Notch1信號通路的異常可以導致機體功能紊亂，致使腫瘤的發生；(NICD)是Notch1的活化片斷；在Notch1信號通路中，當配、受體結合導致受體構象改變時，暴露出受體胞外域的腫瘤壞死因子-α-轉化酶(TACE)金屬蛋白酶切割位點，在TACE作用下，Notch胞外段發生切割，切割后游離的N端裂解片段(胞外區)被配體表達細胞內吞，而保留于受體細胞胞內的C端裂解片段則在γ-secretase的作用下進一步剪切，釋放出游離于胞質中的Notch1受體活化形式(NICD/ICN),活化的NICD轉移至細胞核內，可與轉錄抑制因子RBP-JK(也稱為CSL/CBFl)結合，進而與共活化物Co-A(MAML、組蛋白乙酰基轉移酶p300/CBP)結合后，即成為轉錄活化因子，活化Hes1等分化拮抗基因并募集Groucho/TLE等轉錄共抑制因子，阻礙細胞特異性分化效應基因的表達，最終影響細胞的分化、增殖和凋亡〔9〕。Hes1是一種轉錄抑制因子，可維持細胞未分化狀態，使其保持足夠增殖細胞數目，是Notch1的下游靶基因〔10〕。

本研究說明 Notch1的表達水平與人腦膠質瘤的病理級別相關，與人腦膠質瘤的惡性程度相關 。這與Yao等〔11〕的研究結果一致。本研究還發現Notch1信號通路在發揮作用時，是通過Hes1來向下傳導的。總之，Notch1的表達及活化程度不僅與人腦膠質瘤的病理級別相關，同樣與腫瘤的惡化程度有關。

膠質瘤惡性程度的病理分級是根據其血管化、局灶壞死程度和腫瘤細胞的增殖而決定的〔11〕。ki-67及PCNA不僅是細胞增殖常用的指標，同樣是判斷膠質瘤惡性程度及其預后的指標〔12〕。腫瘤增殖活性的檢測對于判斷其惡性程度、預見其生物學行為以及評估預后和選擇適當的治療措施意義重大。本研究推測,Notch1信號通路可能通過Hes1作用于膠質瘤細胞，促進細胞的增殖，進而參與到腫瘤的形成及惡化。以Notch1信號通路為靶點是臨床研究的新進展及重大挑戰。目前主要的干預有：(1)阻礙Notch受體的激活，包括γ-分泌酶抑制劑(GSIs)。(2)阻礙配體的結合包括單克隆抗體(mAbs)或者誘導劑(decoy)。(3)阻礙NICD的轉錄活性〔13〕。然而，由于Notch1表達的廣泛性，也為治療策略提出了更高的要求。

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〔2016-07-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

河南省醫學科技攻關計劃項目(No.201403318)

黃春波(1982-)，男，主治醫師，主要從事神經外科疾病研究。

R651

A

1005-9202(2017)05-1067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.012

1 首都醫科大學附屬北京天壇醫院基礎醫學院