福辛普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的影響

謝亞芹 趙 娟 李秀華 馮翔宇

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

福辛普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的影響

謝亞芹 趙 娟 李秀華1馮翔宇1

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

目的 探討福辛普利對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 表達(dá)水平的影響。方法 雄性Wistar大鼠50只隨機(jī)抽取10只為假手術(shù)組，其余大鼠采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠CHF模型，6 w后將成模大鼠隨機(jī)分為CHF組、Fos10組、FOS20組(福辛普利10、20 mg·kg-1·d-1)。治療8 w后，觀察各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和左心室重量指數(shù)(LVMI)；透射電鏡觀察左室心肌組織形態(tài)的改變；TUNEL法檢測大鼠左心室心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)；SP免疫組織化學(xué)染色法檢測左心室心肌組織Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 CHF組與假手術(shù)組相比，大鼠左心室舒張末壓(LVEDP)、LVMI、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)顯著下降(P<0.01)；與CHF組比較，F(xiàn)os10組和Fos20組大鼠LVEDP、LVMI、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)顯著升高(P<0.01)，且Fos20組效果明顯。電鏡下觀察：Fos10組和Fos20組心肌損傷程度較CHF組明顯減輕。結(jié)論 福辛普利可通過下調(diào)Caspase-3的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善CHF大鼠心室功能及心肌超微結(jié)構(gòu)。

福辛普利；慢性心力衰竭；超微結(jié)構(gòu)；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

慢性心力衰竭(CHF)發(fā)生時(shí)左室功能的不斷惡化是心肌細(xì)胞凋亡或(和)剩余的心肌細(xì)胞收縮功能代償不足的結(jié)果，而凋亡可能是心肌細(xì)胞不斷丟失的根源所在〔1～3〕。作為第三代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物的福辛普利在逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，降低心臟負(fù)荷的同時(shí)具有作用時(shí)間更長，副作用減少，肝腎雙重排泄等優(yōu)點(diǎn)，因此成為近年來研究的熱點(diǎn)。但其能否抑制CHF心肌細(xì)胞凋亡及作用是否存在劑量依賴性仍需進(jìn)一步研究。本研究將以腹主動(dòng)脈縮窄方式建立慢性壓力負(fù)荷性心力衰竭動(dòng)物模型，觀察福辛普利對(duì)CHF大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號(hào)：2009-0004)，福辛普利(10 mg，商品名：蒙諾，購自中美上海施貴寶制藥有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國羅氏Roche公司)，Caspase-3兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組 將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)抽取10只作為假手術(shù)組，其余大鼠全部采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)制作CHF模型〔4〕。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈而不結(jié)扎。術(shù)后均給予青霉素20萬U連續(xù)3 d腹腔注射，常規(guī)喂養(yǎng)6 w，造模大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快、倦怠無力、食欲減退等表現(xiàn)，模型制備中死亡10只，假手術(shù)組大鼠無死亡。檢測血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg作為成模標(biāo)準(zhǔn)，待成功建立模型后，將成模大鼠隨機(jī)分為3組，即CHF組、Fos10組和Fos20組，每組10只。Fos10組和Fos20組大鼠分別給予福辛普利10 mg·kg-1·d-1和20 mg·kg-1·d-1，CHF組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水灌胃，連續(xù)8 w。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測 將大鼠測體重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)大鼠，經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號(hào)記錄儀系統(tǒng)，獲取LVEDP，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 標(biāo)本制備及計(jì)算左心室重量指數(shù)(LVMI) 福辛普利治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg)，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，分離左心室稱重，后將部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，備用于TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)染色檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。另取1 mm3大小的左心室組織數(shù)塊放入3.1%戊二醛中固定，留待電鏡檢測心肌組織的超微結(jié)構(gòu)改變。LVMI=大鼠左心室重量/大鼠體重。

1.2.4 心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 取1 mm3大小的左心室心肌數(shù)塊放入3.1%戊二醛溶液內(nèi)，經(jīng)0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后再固定于10 %鋨酸溶液中，按電鏡常規(guī)技術(shù)脫水、包埋，用EMUC6 型超薄切片機(jī)(德國萊卡公司)作超薄切片，經(jīng)醋酸鈉與枸櫞酸鉛雙重染色，在H-7650B透射電鏡(日本日立公司)下觀察并照相。

1.2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，proteinase K工作液消化15 min，TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min，過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(shù)(AI)的確定：以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與同一視野神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，每只動(dòng)物任選3張切片，每張切片選取4個(gè)視野，取平均值。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測Caspase-3蛋白的表達(dá) 采用SP法檢測左心室心肌組織Caspase-3蛋白的表達(dá)。Ⅰ抗分別為Caspase-3多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以0.01 mmol/L PBS代替第1抗體作為陰性對(duì)照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對(duì)免疫陽性結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以免疫陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對(duì)含量。每只動(dòng)物任選3張切片，每張切片選取4個(gè)視野，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及LVMI檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，CHF組大鼠LVEDP、LVMI顯著增高(P<0.01)，±dp/dtmax明顯下降(P<0.01)；與CHF組相比，F(xiàn)os10組和Fos20組大鼠LVEDP、LVMI明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax明顯上升(P<0.01)，F(xiàn)os20組效果明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、LVMI、AI及心肌組織Caspase-3表達(dá)比較

與CHF組比較：1)P<0.01;與Fos10組：2)P<0.01

2.2 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 電鏡下觀察：假手術(shù)組心肌細(xì)胞輪廓清晰，粗細(xì)肌絲排列整齊，明暗帶清晰可見，細(xì)胞核呈橢圓形，核仁居中。CHF組心肌細(xì)胞出現(xiàn)心肌凋亡征象，表現(xiàn)為肌絲排列紊亂，肌節(jié)錯(cuò)位、各帶結(jié)構(gòu)分辨不清，部分灶性溶解，線粒體腫脹、嵴不同程度斷裂溶解，心肌細(xì)胞水腫，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集。Fos10組和Fos20組心肌細(xì)胞損傷明顯減輕，細(xì)胞輕度水腫，肌纖維排列規(guī)則，心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變較CHF組明顯減輕。Fos20組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改善優(yōu)于Fos10組。見圖1。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 見表1、圖2。TUNEL陽性產(chǎn)物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀。與假手術(shù)組比較，CHF組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡明顯增多，AI明顯增高(P<0.01)；Fos10組和Fos20組大鼠心肌組織細(xì)胞AI較CHF組明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)os20組降低更為顯著(P<0.01)。

圖1 各組大鼠左心室心肌組織的超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL法，×400)

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 Caspase-3免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色，位于心肌細(xì)胞質(zhì)。CHF組較假手術(shù)組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)增高(P<0.01)，F(xiàn)os10組和Fos20組較CHF組Caspase-3蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)os20組降低更加顯著(P<0.01)。見表1、圖3。

圖3 各組大鼠左心室心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

研究證實(shí)，機(jī)械牽張可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡〔5〕。因此采用縮窄腎上腹主動(dòng)脈所致壓力負(fù)荷增加可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化〔6〕。本研究表明CHF組大鼠明顯出現(xiàn)心功能的惡化，同時(shí)LVMI增加，提示CHF組大鼠心室壁增厚，出現(xiàn)心肌肥厚，在慢性壓力負(fù)荷增加時(shí)，可發(fā)生心肌細(xì)胞的凋亡及心肌纖維化，并最終導(dǎo)致心功能的惡化。福辛普利作為一種ACEI，能夠有效抑制周圍血管及組織緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用，減少血管緊張素Ⅱ的刺激作用，減輕氧化應(yīng)激，提高緩激肽的水平，從而發(fā)揮抗凋亡作用〔7,8〕。本研究顯示福辛普利可改善心室功能，有效抑制了心肌重構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在超微結(jié)構(gòu)上，福辛普利可通過對(duì)保護(hù)線粒體及心肌纖維的正常結(jié)構(gòu)，減少膠原纖維的生成而改善心肌的超微結(jié)構(gòu)，并且高劑量組效果更加顯著。

與壞死不同，細(xì)胞凋亡是受基因控制的程序化的死亡過程。線粒體在缺血、缺氧、 氧化應(yīng)激、細(xì)胞鈣超載等病理?xiàng)l件下，會(huì)發(fā)生腫脹釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-3〔9〕。Caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段〔10〕。現(xiàn)已證實(shí)Caspase-3在心、腦等重要器官缺血再灌注過程及腫瘤細(xì)胞均異常表達(dá)〔11,12〕，參與細(xì)胞凋亡。本研究中通過福辛普利的治療可抑制心肌凋亡基因Caspase-3的表達(dá)，提示對(duì)Caspase-3表達(dá)的抑制作用可能是該藥抗心肌凋亡的分子機(jī)制之一，福辛普利下調(diào)Caspase-3的表達(dá)可呈劑量依賴性。但關(guān)于福辛普利鈉長期應(yīng)用的合理劑量及對(duì)重要臟器的毒副作用等問題還有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-11-27修回〕

(編輯 曹夢園)

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20110180)；河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助(冀教高〔2013〕4號(hào)病理學(xué)與病理生理學(xué))

謝亞芹(1983-)，女，碩士，講師，主要從事心力衰竭的基礎(chǔ)與臨床研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)05-1056-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.007

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科