SH-SY5Y細胞p38 MAPK信號轉導通路對α7尼古丁受體蛋白水平的影響

周 飛 齊曉嵐 吳昌學 官志忠 李 毅

(貴州醫科大學 貴州省醫學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

SH-SY5Y細胞p38 MAPK信號轉導通路對α7尼古丁受體蛋白水平的影響

周 飛1齊曉嵐1吳昌學1官志忠1李 毅1

(貴州醫科大學 貴州省醫學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

目的 研究p38 MAPK信號傳導通路激動及抑制對SH-SY5Y細胞α7神經型乙酰膽堿受體 (nAChR) 蛋白水平的影響并探討受體蛋白與p38通路之間的關系。方法 分別用p38 MAPK激活劑Anisomycin和p38 MAPK阻斷劑SB203580激動和阻斷SH-SY5Y細胞p38 MAPK通路蛋白的活化及其表達，Western印跡方法檢測α7 nAChR蛋白水平。結果 細胞經Anisomycin處理后，p38 MAPK蛋白表達不變，p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平升高了71%(P<0.01)，同時細胞α7 nAChR蛋白表達升高了80%(P<0.01).細胞經SB203580處理后，p38 MAPK蛋白表達不變，p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平降低了62%(P<0.01)，提示p38 MAPK信號通路被抑制，同時細胞α7 nAChR蛋白表達降低了80%(P<0.01)。結論 Anisomycin能激動SH-SY5Y細胞p38 MAPK信號轉導通路，引起α7 nAChR蛋白表達明顯增強；SB203580能阻斷SH-SY5Y細胞p38 MAPK信號轉導通路，引起α7 nAChR蛋白水平顯著降低。

阿爾茨海默病；α7 nAChR；p38 MAPK

神經型乙酰膽堿受體(nAChR)在阿爾茨海默病(AD)中研究較多，α7 nAChR是分布最廣的亞單位之一〔1〕，具有調節認知、學習、記憶等功能〔2,3〕，膽堿能系統障礙和神經損傷可能與α7 nAChR基因、結構及其功能異常有一定關聯〔4〕。 α7 nAChR表達增加能降低Tau蛋白磷酸化水平發揮神經保護作用〔5〕，尼古丁作為膽堿受體興奮劑，可明顯改善認知功能損害〔6〕，因此α7 nAChR激動劑與其陽性變構調節劑結合后對AD治療有重要作用〔7〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路由相關激動的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，其中p38 MAPK參加調節神經細胞存活的整個生命過程，在神經受損及細胞壞死中涉及較多。通過體外激動α7 nAChR可以促進nAChR 離子通道對Ca2+通透性，伴隨Ca2+水平升高MAPK信號系統中的p38通路可被激活并發揮作用〔8〕，調節神經細胞受損后基因的表達。研究顯示激活p38 MAPK可引起神經系統Tau過度磷酸化〔9〕。因此，本實驗將針對AD中影響Tau蛋白磷酸化水平的α7尼古丁受體蛋白及p38 MAPK信號轉導通路展開研究，探索二者之間的關系，為α7 nAChR調節Tau蛋白作用機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的SH-SY5Y神經細胞由本課題組保存；DMEM培養基、血清、0.25%胰酶均來源于Hyclone公司；兔抗人p38 MAPK單克隆抗體(8690s)、兔抗人p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 單克隆抗體(4511s)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(7074s)、SB203580(5633s)均購于美國Cell Signaling公司；兔抗人α7 nAChR多克隆抗體(sc-5544)購于美國Santa公司；鼠抗人β-actin 單克隆抗體(m20010)購于美國Abmart公司；辣根酶標記的羊抗鼠二抗(ZB2305)來源于中杉金橋公司；Anisomycin(A9789-25mg)源于美國Sigma公司；蛋白marker來源于美國Thermo公司；5倍蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)購自日本Dojindo公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均來源于北京索萊寶公司；PVDF膜、ECL-Plus發光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 SH-SY5Y細胞以DMEM為培養基，其中添加10%血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，放入37℃含5% CO2恒溫箱中進行孵育。細胞經0.25%胰酶消化后接種于六孔板中進行培養，待細胞生長至85%～90%時，更換未添加血清及抗生素的DMEM培養基饑餓處理12 h，再分別加入2 ng/ml Anisomycin〔10〕、160 μmol/L SB203580(CCK-8篩選條件)，均處理1 h后收集細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測SH-SY5Y細胞活力 用含10%胎牛血清的DMEM培養基將經胰酶消化后的SH-SY5Y細胞吹打混勻成單細胞懸液，以密度為104/孔接種于96孔板中(邊緣孔用單純DMEM培養基填充，可作為空白孔)，每孔定容100 μl，每組6個復孔，放入培養箱孵育，待細胞生長至孔底80%～85%時，吸掉培養基，每孔加入DMEM培養液100 μl進行饑餓處理，12 h后吸掉單純培養基，根據實驗設計每組加入濃度分別為0、20、40、80、160、320和640 μmol/L的SB203580(用DMEM稀釋)，孵育1 h后吸掉培養基，終止藥物作用，同時周邊空白孔也吸掉原DMEM培養液，最后均加入含10%CCK-8的DMEM培養基，每孔100 μl，于恒溫箱中繼續孵育，1 h后用酶標儀檢測各孔在540 nm處的吸光度(A)值并根據公式：細胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)計算各組細胞存活率。

1.2.3 Western印跡法檢測SH-SY5Y細胞中p38、p-p38及α7 nAChR蛋白水平 細胞加藥處理后，按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制細胞裂解液，分別收集細胞、提取蛋白質并定量蛋白濃度；運用Western印跡方法檢測細胞中p38、p-p38蛋白表達情況，以驗證相應藥物對SH-SY5Y細胞作用條件的篩選；檢測細胞中α7 nAChR蛋白表達情況，觀察藥物作用p38 MAPK通路蛋白后對α7 nAChR蛋白水平的影響。運用Image J 軟件進行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內對照，分別計算p38、p-p38、α7 nAChR蛋白條帶相對其內參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達水平。每組蛋白3個復孔，至少重復3次獨立實驗。

1.3 統計學分析 運用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 不同濃度SB203580對SH-SY5Y細胞活力的影響 經不同濃度的SB203580處理后，細胞活力值逐漸下降且呈現劑量依賴關系，在20、40和80 μmol/L SB203580作用時，細胞活力(90±2、86±12、85±6)降低，但與對照組(100±0.8)相比無統計學差異(P>0.05);隨著SB203580濃度增加，細胞活力明顯下降，160、320和640 μmol/L組的細胞活力(83±7、51±7、5±1)分別是對照組的83%(P<0.05)、50%(P<0.01)和5%(P<0.01)。因為160 μmol/L是使細胞活力下降最低即相對存活率最高的濃度，因此后續實驗使用的SB203580濃度均為160 μmol/L。

2.2 SB203580對p38 MAPK信號通路蛋白水平的影響 與對照組相比(92±8)，SB203580組p38蛋白質水平(92±8)保持不變，p-p38蛋白質水平降低了62%(對照組105±6，SB203580組40±7)(P<0.01)，說明160 μmol/L的SB203580作用SH-SY5Y細胞1 h后p38 MAPK通路被明顯抑制。見圖1。

圖1 SB203580對細胞p38、p-p38蛋白水平的影響

2.3 Anisomycin對p38 MAPK信號通路蛋白水平的影響 與對照組(p38:94±6,p-p38:105±9)相比，p38蛋白質水平(93±7)保持不變，p-p38蛋白質水平(30±8)升高了71%(P<0.01)，說明2 ng/ml的Anisomycin作用SH-SY5Y細胞1 h后p38 MAPK通路被顯著激活。見圖2。

圖2 Anisomycin對細胞p38、p-p38蛋白水平影響

2.4 p38 MAPK信號通路對α7 nAChR蛋白水平的影響 與對照組(102±7、104±11)相比，Anisomycin處理組細胞α7 nAChR蛋白水平(184±7)升高了80%(P<0.01)，SB203580處理組細胞α7 nAChR蛋白水平(20±5)降低了80%(P<0.01),說明p38 MAPK通路激活引起α7 nAChR蛋白表達升高，p38通路抑制引起α7 nAChR蛋白水平降低。見圖3。

圖3 Anisomycin及SB203580對細胞α7 nAChR蛋白水平影響

3 討 論

目前AD發病年齡逐步提前且發病率逐年上升，加快對該病的探索及有效的防治研究已迫在眉睫〔11〕。在AD的病程發展中nAChR數目明顯減少〔12,13〕，α7 nAChR是其重要組成部分，研究表明，降低α7 nAChR活力可增強Aβ誘導的膽堿系統紊亂及神經毒性〔14,15〕，激活α7 nAChR不僅可以促進神經元興奮〔16〕，還可對抗神經毒性，減弱Aβ誘導的神經細胞凋亡〔13〕，發揮一定的神經保護作用，還能提高AD患者的認知水平及其空間學習記憶能力〔17〕。因此，α7 nAChR激動劑已被證實為一種前景較好的AD治療藥〔18〕。

MAPK傳導通路是體內的一條基本信息傳遞鏈，參與調節細胞生長、分化、凋亡等整個生命過程〔19〕，p38 MAPK是其重要成員。研究表明，Aβ可通過激活p38 MAPK信號途徑引起細胞凋亡〔20〕，Tau蛋白磷酸化可促進MAPK激動，通過細胞周期活化機制引起神經損傷〔21〕，因此tau蛋白及Aβ引起的神經毒性都與p38 MAPK激活存在一定聯系〔22〕，在AD的預防與治療研究中發現，抑制p38信號傳導通路可抵抗Aβ毒性〔23〕，p38 MAPK阻斷劑可能會成為治療認知功能障礙性疾病的新靶點〔24〕。

本實驗結果顯示，p38 MAPK通路被阻斷時α7 nAChR蛋白表達明顯降低，可能與神經損傷機制減少需降低保護機制以維持機體平衡有關；p38 MAPK通路被激活后α7 nAChR蛋白表達明顯升高，可增強機體抵抗力發揮一定的神經保護作用抵抗毒性損傷。綜上所述，α7 nAChR蛋白水平可受p38 MAPK通路的影響，并與通路蛋白水平變化呈正相關，說明p38 MAPK信號傳導通路對α7 nAChR具有非常強的調控作用，在尼古丁受體調節AD的機制研究中p38 MAPK可能會成為一個新的關鍵和重要突破點。

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〔2016-12-20修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金資助項目(81360178)；貴州省教育廳“2011協同創新中心”(黔教合協同創新中心〔2014〕06)；貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項目(黔科合SY字〔2013〕3020;黔科合LH字〔2016〕7365；

李 毅(1978-)，男，中級實驗師，碩士，主要從事老年性癡呆研究。

周 飛(1990-)，女，碩士，主要從事神經分子生物學研究。

R749.01

A

1005-9202(2017)05-1047-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.003

1 貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室