缺氧對大鼠心肌細胞損傷的影響及機制

宋佳卉 牛 楠 朱明星 佟雪琪 趙殷奇 徐士梅 宋 熔 趙 巍

(寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004)

缺氧對大鼠心肌細胞損傷的影響及機制

宋佳卉 牛 楠1朱明星1佟雪琪2趙殷奇1徐士梅 宋 熔3趙 巍1

(寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討缺氧對大鼠心肌細胞系H9C2的損傷及機制。方法 在1%O2+5%CO2+94%N2條件下培養大鼠心肌細胞株H9C2 3、6、12、24、48 h，并以正常大鼠心肌細胞株作對照，使用臺盼藍進行細胞計數；CCK-8法檢測細胞存活率；實時監測心肌細胞生長狀態；透射電鏡觀察細胞內部結構；活性氧檢測試劑盒檢測胞內活性氧(ROS)；Western印跡法檢測線粒體色素C蛋白表達水平；流式細胞術檢測細胞凋亡率；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測細胞壞死程度。結果 缺氧狀態下，隨著缺氧時間的不斷增加,大鼠心肌細胞株H9C2的細胞生長、存活率均明顯降低、細胞形態明顯改變，細胞器結構明顯損傷，ROS水平升高，線粒體細胞色素釋放增加，細胞凋亡率明顯增加，LDH的釋放率明顯增高。結論 缺氧會造成大鼠心肌細胞的生長速度減慢、形態改變及心肌線粒體損傷，最終導致細胞凋亡和細胞壞死。

缺氧；線粒體損傷；凋亡；壞死

心肌梗死的發病率和死亡率均居于心血管疾病的首位〔1〕。心肌梗死是冠狀動脈閉塞、血流中斷，使部分心肌因嚴重的持久性缺血從而發生局部壞死。而冠狀動脈閉塞必然導致心肌細胞缺氧，所以氧氣是重要的病理生理調節因素，心臟的功能活動是否正常取決于心肌細胞是否獲得足夠的氧氣，而心肌細胞較其他類型細胞對缺氧更敏感〔2〕。心肌缺氧能夠導致心肌細胞損傷，從而引發各類心臟疾病。因此，如何糾正缺氧對心肌細胞造成的損傷，這可能是治療、緩解各種心臟類疾病的研究方向〔3,4〕。本研究以缺氧為基本條件，探究細胞在缺氧環境中生長、形態的損傷程度以及相關機制，為藥物治療及生物技術治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2(上海中科院細胞庫)。DMEM高糖培養基(Thermo公司)、胎牛血清(Sigma公司)、臺盼藍(北京中生瑞泰科技有限公司)、0.25%胰酶(美國Hyclone公司)、CCK-8細胞周期檢測試劑盒(貝博公司)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、Annexin V-APC(伯樂公司)、7-AAD(伯樂公司)、細胞色素C單克隆抗體(兔抗大鼠，Abcam公司)、山羊抗兔辣根過氧化物酶標抗體(中杉金橋)、細胞線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術公司)。三氣培養箱(Thermo公司)、CellAsic Onix(德國 Merck)、透射電鏡(日立H7650)、流式細胞儀(BD Accuri C6)等。

1.2 方法

1.2.1 細胞計數 取生長狀態良好的大鼠心肌細胞H9C2，胰酶消化，計數，將細胞按照相同的細胞數2×105個/ml接種在兩塊96孔板上，每組設置5個復孔，培養過夜，將一組細胞取出，放置在5%CO2+1%O2+94%N2的三氣培養箱中培養3、6、12、24、48 h，另一組正常培養3、6、12、24、48 h，然后使用臺盼藍染色并計數兩組細胞數,繪制細胞生長曲線。

1.2.2 細胞活力的檢測 取生長狀態良好的大鼠心肌細胞H9C2，待其融合度為80%左右時，使用胰酶消化，計數細胞后密度為2×105個/ml。加細胞懸液于96孔板中(每孔100 μl)，每組設置5個孔，置37℃，5%CO2培養箱中過夜；第2天，將一組細胞取出，放置在1%O2缺氧培養箱中培養，另一組正常培養，缺氧培養至1.5 h后，兩組細胞每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續缺氧培養1.5 h，共缺氧培養3 h后，取出96孔板，避光，測定450 nm各孔的吸光值。缺氧6、12、24、48 h 細胞活力的檢測也如上述步驟。細胞活力的計算：細胞活力=(缺氧細胞OD-空白OD)/(正常細胞OD-空白OD)×100%。

1.2.3 細胞形態變化的檢測 利用CellAsic實時細胞檢測儀，將儀器配套細胞板(M04S)進行前處理，5%CO2、95%空氣、37℃。每孔導入細胞2×105個/ml，12 h貼壁后,5%CO2、5%空氣、90%N2、37℃開始缺氧。6、12、24、48 h同一觀測地點，10×放大倍數，分別拍攝形態圖。

1.2.4 透射電鏡觀察 收集正常培養細胞和缺氧培養24 h的細胞，分別用2%戊二醛固定,1%鋨酸固定1 h,洗滌后丙醛脫水,環氧樹脂包埋，切片。使用透射電子顯微鏡觀察并攝片。

1.2.5 細胞活性氧(ROS)檢測 取6孔板中正常培養的大鼠心肌細胞與缺氧24 h的細胞，更換新培養基后每孔加入1 μl DCFH-DA，37℃細胞培養箱內避光孵育50 min后消化，無血清培養基重懸。利用流式細胞儀488 nm激發和525 nm發射檢測平均熒光強度代表ROS量。

1.2.6 Western印跡檢測胞漿細胞色素C蛋白的表達水平 取大鼠心肌細胞H9C2正常培養與缺氧24 h后，使用線粒體分離試劑盒分離出線粒體蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔以50 μg樣品上樣，并進行SDS-PAGE電泳。PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(細胞色素C)4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，ECL化學顯色,Image Lab軟件進行分析。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用7-AAD及Annexin V-APC對細胞進行標記，首先取生長狀態良好的細胞，胰酶消化后，計數2×106個/ml接種于兩塊6孔板中，置37℃，5%CO2培

養箱中過夜；其中一塊板放入三氣培養箱缺氧培養24 h，胰酶消化收集細胞，用含有2% BSA的PBS洗滌細胞2次，收集細胞后，加入500 μl的上樣緩沖液重懸，然后加入5 μl AnnexinV-APC冰浴10 min，加入1 μl 7-AAD冰浴10 min后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.8 壞死細胞檢測 使用LDH試劑盒并按照試劑盒說明書進行操作，用于大鼠心肌細胞壞死的檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 使用臺盼藍染色法對不同時間段的細胞進行計數 與正常培養的細胞相比，缺氧后細胞數量均明顯降低。而隨著缺氧時間的延長，缺氧3、6、12、24、48 h后細胞數量呈現下降趨勢。見表1。

2.2 細胞形態檢測 經CellAisc實時觀察，正常氧氣濃度培養的心肌細胞全部貼壁生長，細胞核突出明顯，貼壁后細胞為菱形、梭形或多角形，伸出偽足，形成不規則的星形并形成放射狀排列的細胞簇。開始缺氧6 h后心肌細胞活力開始下降，搏動次數減少，心肌細胞形態開始發生改變，細胞簇周圍有部分脫落，使細胞單層由橢圓形變成梭形，缺氧12 h后形態發生很大變化，心肌細胞的胞質出現空泡和粗大顆粒樣物質，細胞皺縮、脫落,見圖1。

表1 臺盼藍染色細胞計數±s，OD值)

與正常培養組比較:1)P<0.01

圖1 利用CellAsic觀測缺氧狀態下的大鼠心肌細胞(×10)

2.3 透射電鏡觀察細胞超微結構 正常對照組心肌細胞結構基本正常,核結構正常，線粒體結構清晰。缺氧組可見心肌細胞線粒體排列紊亂、腫脹,空泡或囊泡化,細胞核形狀不規則,核膜溶解個被地方甚至消失。外膜不完整,少部分線粒體損傷嚴重,破裂,溶解,見圖2。

2.4 ROS檢測結果 缺氧24 h處理能顯著提高細胞內的ROS水平，熒光強度也顯著增加(P<0.01)。正常培養組與缺氧24 h組中細胞內ROS表達水平分別為0.90±0.20，7.73±1.25，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.5 Western印跡檢測細胞色素C蛋白的表達水平 正常培養組與缺氧24 h組中細胞色素C表達水平分別為0.48±0.20和1.41±0.30；與正常組比較，缺氧24 h組細胞色素C蛋白的表達水平升高了1.94倍(P<0.05)。見圖3。

圖2 透射電鏡顯示的心肌細胞超微結構變化(×25 000)

圖3 正常培養組與缺氧24 h組細胞色素C表達水平

2.6 流式細胞術檢測結果 正常培養組與缺氧24 h組中細胞凋亡水平分別為0.27±0.02和0.53±0.03，與正常培養組比較，缺血24 h組升高了0.97倍(P<0.05)。

2.7 LDH檢測結果 與正常培養組相比(0 h：6.23±3.12，3 h：6.58±3.21，6 h：6.64±0.54，12 h：7.43±2.89，24 h：5.31±4.36，48 h：11.43±2.83)，缺氧組的LDH水平(0 h：6.23±3.12，3 h：12.57±0.78，6 h：16.03±2.19,12 h：37.87±7.42,24 h：44.57±3.03,48 h:46.84±6.82)明顯上升(P<0.01)。

3 討 論

缺氧能夠造成心肌細胞損傷，最終導致心臟疾病加重。因此，如何抵御缺氧對心肌細胞造成的損傷是延緩心臟病發生發展的有效途徑。目前研究表明，缺氧可影響細胞的存活及生長〔5〕，對于缺氧造成的細胞凋亡及細胞損傷的機制也進行了相關的分析〔6,7〕，但這些研究并不系統全面。缺氧會導致細胞生長減慢〔8〕，活力降低。本研究結果也說明缺氧造成細胞活力降低可能會引起細胞死亡。本實驗通過實時動態觀察，發現隨著缺氧6 h開始心肌細胞形態明顯受損，直至缺氧48 h完全失去細胞形態而死亡。通過對細胞生長、活力以及形態的觀察，同時考慮到時間和細胞受損程度，該實驗選擇24 h作為最佳缺氧時間點。超微病理改變是反映細胞損傷最直觀、最有效的指標〔9,10〕。結果顯示，缺氧狀態對大鼠心肌細胞的細胞膜、核膜尤其是線粒體可以造成明顯損傷。線粒體是心肌細胞中最主要、含量最多的細胞器，也是產生ROS的重要場所。心肌缺氧過程中，在缺氧的作用下氧化應激平衡失調，心肌細胞線粒體內產生大量ROS，導致線粒體膜和細胞膜脂質過氧化、線粒體DNA損傷及細胞凋亡啟動〔11〕。因此，線粒體ROS過表達是缺氧損傷機制中的一個重要環節。本研究提示缺氧可能造成了線粒體的損傷。而線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用〔12〕，在細胞受到刺激凋亡時線粒體釋放細胞色素C和凋亡誘導因子，從而激發下游的凋亡執行者，在凋亡中線粒體的作用是相當重要的，也比較復雜，是近年來科研的熱點。線粒體釋放的細胞色素C是重要的凋亡誘導分子〔13〕。本實驗利用Western印跡方法和流式細胞術對缺氧24 h細胞進行檢測，發現線粒體釋放的細胞色素C大量增加，細胞凋亡率也明顯增加。說明可能是缺氧造成的線粒體損傷從而引發細胞凋亡〔14〕。有文獻表明，缺氧可抑制大鼠心肌細胞的增殖，促進心肌細胞的凋亡，凋亡程度隨缺氧時間的延長而加重，隨著缺氧時間的延長死亡細胞逐漸增多〔15〕。細胞死亡的方式又分為細胞凋亡和細胞壞死。對細胞壞死，目前普遍的檢測手段是LDH檢測。LDH是機體能量代謝中的一種重要酶，LDH漏出量多少可反映細胞膜的損傷，其外漏程度可間接反映缺氧受損程度〔16〕，細胞損傷后，胞內LDH大量漏出，從上清液中LDH的含量可反映細胞的損傷程度〔17,18〕。本實驗發現，缺氧狀態下造成大鼠心肌細胞中LDH的釋放量明顯增加，細胞死亡率顯著上升。

綜上所述，本實驗說明大鼠缺氧狀態下會造成心肌細胞生長減慢、活力降低、形態改變、線粒體損傷和細胞凋亡以及細胞壞死，為深入研究損傷機制和尋求損傷后的保護措施奠定了基礎，為臨床治療提供參考依據。

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〔2016-10-27修回〕

(編輯 李相軍)

The mechanism of hypoxia on rat myocardial cell damage

SONG Jia-Hui，NIU Nan,ZHU Ming-Xing,etal.

Basic Medical College of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the damage and the mechanism of hypoxia on rat cardiomyocytes H9C2 of rats.Methods The cardiac muscle cell line H9C2 of rats was cultured under the conditions of 1%O2, 5%CO2, 94%N2and keeping for 3,6,12,24, 48 h.The cell count and the cell growth curves were plotted using the Trypan Blue,the cell survive rate was detected by CCK-8 assay. The degree of cell necrosis was detected by lactate dehydrogenase (LDH) kit, the flow cytometry was used to detect the apoptosis rate, mitochondrial cytochrome C was detected by Western blot, the reactive oxygen was tested by reactive oxygen assay kit, the intracellular structure was observed by TEM.Results Under the condition of hypoxic, while the time of hypoxia increasing, the cell growth and survival rate were significantly decreased, cell morphology had been changed significantly, the release rate of LDH was obviously increased, the apoptosis rate was clearly increased, the cytochrome enzymes was increased, the levels of reactive oxygen species were elevated, cell structure was damaged apparently.Conclusions Hypoxia could change the myocardial cell morphological, slow down the rate of cell growth, causing the cell necrosis or apoptosis and damaging the myocardial mitochondrial.

Hypoxia; Mitochondrial damage; Apoptosis; Necrosis

國家自然科學基金項目資助(81360042)

宋 熔(1971-)，女，副主任醫師，主要從事心力衰竭發病機制與防治研究。 趙 巍(1960-)，男，教授，主要從事分子遺傳研究。

宋佳卉(1991-)，女，在讀碩士，主要從事分子遺傳學研究。

R34

A

1005-9202(2017)05-1044-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.002

1 寧夏醫科大學科技中心 2 寧夏醫科大學臨床醫學院

3 中國人民解放軍第五醫院重癥醫學科