電針對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響

范茜茜 董 勤 沈梅紅 李 茜 趙小文 吳錦萍

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京 210046)

·基礎研究·

電針對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響

范茜茜 董 勤 沈梅紅 李 茜 趙小文 吳錦萍

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京 210046)

目的 探討電針對腦缺血再灌注大鼠皮質細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表達的影響。方法 雄性清潔級SD大鼠72只，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組和電針組各24只。用改良Longa線栓法制作大鼠右側大腦中動脈腦缺血模型，缺血2 h，于再灌注開始后電針組針刺“百會”和“大椎”穴。各組于缺血再灌注24 h后行神經行為學評分和腦含水量測定，免疫組化染色法檢測缺損側皮層組織Bcl-2、Bax的蛋白表達，qRT-PCR檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達的變化。結果 模型組、電針組神經行為學評分均低于假手術組(P<0.01),與模型組比較，電針組的神經行為學評分升高(P<0.05)。與假手術組比較，模型組腦含水量明顯增高(P<0.01)，電針組的差異無統計學意義(P>0.05),較之模型組，電針組的腦含水量顯蓍降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組、電針組Bcl-2蛋白及mRNA的表達均顯著增多(P<0.05或P<0.01)，電針組又高于模型組(P<0.05)；較之假手術組，模型組Bax蛋白及mRNA表達顯著上升(P<0.01)，電針組無明顯差異(P>0.05)，電針組較模型組顯著降低(P<0.01)；Bcl-2/Bax及Bcl-2 mRNA/Baxm RNA的比值，模型組降低而電針組升高(P<0.01)。結論 電針可以通過提升Bcl-2/Bax的比值使抗凋亡基因占據優勢，從而抑制缺血再灌注區的細胞凋亡，減輕腦水腫，促進神經功能恢復。

電針；腦缺血再灌注；細胞凋亡；Bcl-2；Bax

神經細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷的病理過程中起重要作用，缺血性腦卒中神經細胞損害的重要機制，從基因分子學來看，神經元凋亡最重要的調節者是兩個分子家族——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族和Bcl-2蛋白家族。目前，Bcl-2和Bax在腦缺血再灌注RKM WTL 與細胞凋亡中的作用受到廣泛關注，針刺對Bcl-2家族中的Bcl-2有促進其表達的作用，對Bax有抑制其表達的作用。本研究以此為切入點，結合神經行為學評分、腦組織含水量的改變等指標，進一步綜合探討針刺的調控特點，為針刺治療缺血性腦中風的效應機制提供更豐富的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性清潔級SD大鼠72只，體重(280±20)g，購自北京維通利華動物實驗中心〔許可證號SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠飼養于南京中醫藥大學動物中心〔12 h/12 h晝夜節律、(22±2)℃室溫、50%～60%濕度，通風良好〕。適應性飼養1 w，大鼠自由攝食與飲水。采用隨機數字表法隨機抽取24只為假手術組，余下動物采用改良Longa線栓法構建腦缺血再灌注模型。將造模成功的大鼠按照隨機數字表進行隨機分組，分別為再灌注24 h組(下稱模型組)，再灌注24 h+電針組(下稱電針組)，每組有效例數為24只。

1.2 主要儀器與試劑 華佗牌一次性毫針，規格0.20×13 mm2(蘇州醫療用品廠有限公司)、韓氏HANS-200型電針儀(南京濟生醫療有限公司)；石蠟切片機RM2145(德國LEICA公司)；TP1020型生物組織烘片機(德國LEICA公司)；干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；熒光多功能顯微鏡BX60(日本OLYMPUS公司)；圖像分析儀(CMIAS 98A，北京航空航天大學)；DP71圖像獲取系統(日本OLYMPUS公司)；核酸蛋白檢測儀(德國Eppendorf公司)；Verity 96孔板熱循環儀(美國Applied Biosystems公司)；PCR擴增儀7500(美國Applied Biosystems公司)。兔抗大鼠單克隆抗體Bcl-2(ab7973)、Bax(ab32503)一抗(上海Abcam貿易有限公司)；5%BSA胎牛血清(封閉液)、生物素化羊抗兔IgG(二抗)、鏈酶親和素-生物素復合物(SABC)及二氨基聯苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德生物工程有限公司)；RT-PCR反轉錄試劑盒(大連TaKaRa生物公司)。

1.3 局灶性腦缺血模型制備 采用改良Longa線栓法制備腦缺血再灌注模型〔1〕。選擇直徑為0.28 mm的魚線，頭端加熱使其變成光滑球面(直徑約0.30 mm)，然后剪成長約(60±0.5)mm線栓，用直尺將其平均分為三等分(每份約20 mm±0.5 mm)，75%的酒精清潔處理后備用。將大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后仰位固定，頸部備皮，鋪孔巾后切開皮膚，分離右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。結扎剪斷頸外動脈后，通過頸外動脈遠心殘端緩慢插入線栓,經頸內動脈進入大腦中動脈，插入深度約為(18±1.5)mm，當遇到一定阻力時立即停止插線，此時線栓頭端已到達大腦中動脈的入口。將線栓入口處結扎固定，防止線栓脫落出血，縫合皮膚并消毒，外留1 cm線栓，將大鼠單獨仰臥在鼠籠中。大鼠缺血2 h后輕輕拔出線栓，實現缺血再灌注。大鼠清醒后自由飲水和攝食。所有大鼠在術前禁食12 h，但自由飲水。

1.4 各組處理方法 假手術組：除不穿入線栓外，其余操作與模型組相同。模型組：采用改良Longa線栓法制備，缺血2 h后拔出線栓，模型建立后不進行任何干預處理。電針組：建立模型，缺血2 h后拔出線栓再灌注同時電針“百會”、“大椎”穴。參照《實驗針灸學》〔2〕動物穴位圖譜選取“百會”、“大椎”穴，用0.20 mm×13 mm的一次性不銹鋼毫針針刺，“百會”穴平刺，“大椎”穴約30°角斜刺，深度為10 mm。接韓氏HANS-200型電針儀，“百會”穴接負極，“大椎”穴接正極。刺激參數：疏密波，頻率2/15 Hz，刺激強度以針柄輕微顫動，且動物不嘶叫為宜。持續電刺激30 min。

1.5 觀測指標 大鼠缺血2 h再灌注24 h后給予神經行為學評分，然后斷頭處死，其中8只行腦組織含水量測定;8只經4%多聚甲醛心臟灌流后取腦，行免疫組化檢測;另8只取損傷灶周邊組織，液氮速凍，-70℃冰箱保存，行qRT-PCR檢測。

1.5.1 神經行為學評分 腦缺血再灌注24 h后，參照Julio氏18分制〔3〕評分法進行大鼠的神經功能行為學評分，標準：①自發活動(0～3分)，在大鼠籠中觀察5 min，觀察其靠近籠壁及探究環境的能力；②提尾觀察四肢運動的對稱性(0～3分)；③將大鼠置于桌子邊緣，保持后腿騰空，觀察兩前肢運動的對稱性(0～3分)；④觀察攀爬能力，提尾拉下時感受其攀附力(1～3)；⑤本體感覺(1～3)，用鈍棒觸摸其兩側，觀察其對刺激的反應；⑥觸須反應(1～3)，從動物后面用鈍棒觸胡須，觀察其反應，6項評分相加為總積分，評分范圍3～18分，18分為正常。

1.5.2 腦含水量測定 采用干濕重稱量法計算。實驗動物再灌注24 h后斷頭取腦，用濾紙吸盡表面血漬后，去除嗅球、小腦和低位腦干，銳性刀片分離左右半球，將損傷側半球的腦組織用電子分析天平稱其濕重后，置于105℃恒溫干燥箱內持續干燥24 h后稱其干重，按照公式：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，計算腦組織含水量。

1.5.3 缺損側大腦皮層Bcl-2、Bax蛋白表達 采用免疫組化法檢測。大鼠經10%水合氯醛麻醉后，經左心室依次使用0.9%氯化鈉鹽溶液250 ml和250 ml 4%多聚甲醛溶液灌注固定到大鼠身體發僵后，迅速斷頭取出腦組織標本。腦組織標本保存于4℃的10%中性甲醛溶液中。24 h后依次從低濃度到高濃度的乙醇溶液中逐漸脫去腦組織中的水分，并使用二甲苯透明，最后石蠟包埋。在大鼠缺損側大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm處連續切取約6 μm厚腦組織切片，石蠟切片經常規脫蠟、水化后，滴加Bcl-2、Bax一抗，按試劑盒說明常規SABC法對切片標本進行染色，DAB顯色，蒸餾水洗、脫水、透明、封片。染色結果陽性細胞為黃色或黃棕色。將已染好的切片放在熒光多功能顯微鏡40×10倍視野下隨機選擇不重疊缺損側頂顳區皮層的5個視野觀察Bcl-2、Bax的陽性表達，用圖像分析軟件計算陽性細胞的積分光密度值(IOD)，所得數據取其均值。

1.5.4 缺損側大腦皮層Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達 采用qRT-PCR法進行檢測。大鼠缺血再灌注24 h后，在冰盤上迅速分離梗死側皮層，經液氮包埋速凍。置于-80℃低溫冰箱中保存。經總RNA提取，逆轉錄合成cDNA后，進行PCR反應。反應條件：95℃ 預變性2 min；95℃ 變性15 s，55℃退火延伸35 s，擴增40個循環；72℃ 5 min。55℃ 35 s讀取熒光強度。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 電針對腦缺血再灌注大鼠神經功能行為學評分的影響 腦缺血再灌注24 h后，模型組〔(9.25±1.71)分〕、電針組〔(12.00±1.58)分〕神經行為學評分均低于假手術組〔(15.10±1.52)分〕(均P<0.01)；與模型組比較，電針組的神經行為學評分升高(P<0.05)。

2.2 電針對腦缺血再灌注大鼠腦含水量的影響 與假手術組〔(79.49±0.94)%〕比較，再灌注24 h后模型組腦含水量〔(81.88±1.84)%〕明顯增高(P<0.01)，而電針組〔(79.75±1.11)%〕與假手術組之間差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組的腦含水量顯著降低(P<0.01)。

2.3 電針對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組、電針組再灌注24 h后Bcl-2蛋白表達均顯著增多(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，電針組水平升高(P<0.05)。與假手術組比較，模型組Bax蛋白表達明顯上升(P<0.01)，而電針組略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組Bax蛋白表達較低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組Bcl-2/Bax蛋白比值降低，電針組比值升高(P<0.01)，電針組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠大腦皮層組織Bcl-2、Bax 蛋白表達的比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

2.5 電針對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組、電針組Bcl-2 mRNA表達均顯著增多(P<0.05和P<0.01)；與模型組比較，電針組Bcl-2 mRNA表達略有升高，無統計學差異(P>0.05)。與假手術組比較，模型組Bax mRNA的表達明顯上升(P<0.05)，而電針組無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，電針組Bax mRNA的表達降低(P<0.05)。與假手術組比較，模型組Bcl-2/Bax mRNA的比值降低，而電針組比值升高(P<0.05和P<0.01)；電針組與模型組比較亦有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠皮層組織Bcl-2 mRNA、 Bax mRNA表達的變化

與假手術組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

參與細胞凋亡調節的內部因子很多，而Bcl-2家族相關基因是腦缺血神經元凋亡調控基因的重要組成部分。目前已知的凋亡調節蛋白中Bcl-2家族在各類刺激信號引起的凋亡中起到關鍵的作用〔4〕。Bcl-2蛋白家族包括兩類功能相反的基因，一類是抑制細胞凋亡的基因，以 Bcl-2為代表；另一類是促進細胞凋亡，以Bax為代表，它與Bcl-2具有較高的同源性，可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用，誘導細胞凋亡。

腦缺血損傷后傷側大腦廣泛存在凋亡現象，以皮層及海馬為甚,大腦皮層是創傷損傷部位,神經元對外源刺激因素較敏感,可發生細胞壞死〔5〕。楊云華等〔5〕研究發現，Bcl-2、Bax基因在傷腦表達增高，其增高的時相與凋亡規律相似，表達與細胞凋亡發生呈正相關。說明在傷后的大腦中，Bcl-2、Bax基因處于矛盾的交爭中，當Bax誘導腦細胞調亡時，大腦的自我修復系統同時啟動Bcl-2抑制細胞凋亡途徑，最大可能減輕腦神經元的損害。Bax和Bc1-2表達比率是決定細胞是否會發生凋亡的重要因素。韓英等〔6〕實驗中觀察到，Bax在腦缺血損傷再灌注時表達增加，與Bcl-2形成同源二聚體促進細胞凋亡，同時在鄰近半暗帶生存神經元Bcl-2表達的上調反映了一種保護作用，但缺血再灌注組Bcl-2/Bax比值降低，終致凋亡細胞增加?？梢?，二者表達的相對水平高低與凋亡調控直接相關。

針刺能明顯提高Bcl-2 表達，同時降低Bax 表達。如陶靜等〔7〕于腦缺血再灌注2 h后開始電針患側“曲池”、“足三里”穴，24 h后檢測表明，Bcl-2 表達增高，Bax 表達下降，從而對抗腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡起到抗凋亡的腦保護作用。何娜等〔8〕觀察大鼠腦缺血再灌注模型建立后針刺外關、足三里后細胞凋亡蛋白的變化，針刺組Bcl-2的表達明顯高于假手術組，Bax的表達與假手術組基本相似，證明針刺治療腦梗死可升高Bcl-2和降低Bax的表達，從而抑制腦細胞的凋亡，改善神經功能。

本研究結果顯示，在腦缺血后神經細胞凋亡過程中，Bcl-2蛋白與Bax 蛋白二者表達的平衡結果決定細胞存活或死亡，電針可以通過調控內源性凋亡途徑促進抗細胞凋亡基因Bcl-2的作用，抑制Bax的促凋亡作用，但并非單純表現為升高Bcl-2或降低Bax的絕對值，關鍵在于提升Bcl-2/Bax的比值，使抗凋亡基因占據優勢，從而達到降低缺血再灌注區的細胞凋亡、減輕腦水腫、促進神經功能恢復的目的。

1 李忠仁,崔 龍.“TC”指數在改良LONGA線栓法局灶性腦缺血/再灌流動物模型制備中的應用〔J〕.中國中西醫結合雜志,2006;26(91):18-20.

2 余曙光，徐 斌.實驗針灸學〔M〕.北京:人民衛生出版社，2012:277.

3 Garcia JH,Wagner S,Liu KF,etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.Stroke,1995;26(4):627-35.

4 Babu PP,Suzuki G,Ono Y,etal.Attenuation of ischemia and/or reperfusion injury during myocardial infarction using mild hypothermia in rats:an immunohistochemical study of Bcl-2,Bax,Bak and TUNEL〔J〕.Pathol Int,2004;54(12):896-903.

5 楊云華,張可成,張藝梅.大鼠腦創傷細胞凋亡和Bcl-2基因家族表達的變化〔J〕.西南國防醫藥,2009;19(5):488-91.

6 韓 英,劉 楠,陳榮華,等.大鼠腦缺血再灌注損傷后的細胞凋亡與Bcl-2、Bax的表達〔J〕.中國臨床神經科學,2006;14(1):15-9.

7 陶 靜,陳阿貞,蘭 嵐,等.電針對大鼠早期局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡機制的研究〔J〕.中國康復醫學雜志,2014;29(1):3-8.

8 何 娜,朱春雷,何 欣.針刺治療腦梗死對神經元保護作用機制的實驗研究〔J〕.當代醫學,2012;18(9):3-4.

〔2016-06-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

Influence of electroacupuncture on the expression of apoptosis related genes Bcl-2 and Bax in rats with cerebral ischemia reperfusion injury

FAN Qian-Qian,DONG Qin,SHEN Mei-Hong,etal.

The Second Clinical Medical College of Nan Jing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,Jiangsu,China

Objective To observe the influence of electroacupuncture(EA) on the expression of apoptosis related protein Bcl-2,Bax and mRNA in rats with cerebral ischemia and reperfusion.Methods The male 72 grade clean SD rats,using the random number table method ,were divided into sham operation, model and EA groups with 24 rats in each group.The right middle cerebral artery occlusion models were induced by modified Longa suture method,and 2 hours later,EA group after reperfusion was given acupuncture "Baihui" and "Dazhui".The neurological behavior score and brain water content were measured by 24 hours after ischemia and reperfusion. The immunohistochemical staining method was used to detect defects of lateral cortex tissue Bcl-2, Bax protein expression. qRT-PCR was used to detect the changes of Bax and Bcl-2 mRNA expressions.Results The scores of neurological behavior in EA and model groups were lower than those in the sham operation group(P<0.01);Compared with that of model group,the neurological behavior score of EA group was increased(P<0.05).Compared with that of sham operation group,the brain water content was significantly increased in model group (P<0.01);However,there was no significant difference in EA group(P>0.05); Compared with that of model group, the brain water content of EA group was decreased noticeable(P<0.01). Compared with those of sham operation and model groups, the expressions of Bcl-2 protein and mRNA of EA group were significantly increased(P<0.05 orP<0.01), the expressions of Bax protein and mRNA Bax of model group were significantly increased(P<0.01). The ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax of model group were decreased and those of EA group were increased(P<0.01).Conclusions EA could improve the ratio of Bcl-2/Bax to take advantage of the anti apoptotic gene and to inhibit the cell apoptosis, reduce the brain edema and promote the recovery of neural function.

EA;Cerebral ischemia reperfusion;Apoptosis;Bcl-2 gene;Bax gene

國家自然科學基金資助項目(81373748)

董 勤(1961-)，女，教授，碩士生導師，主要從事針灸臨床研究。 沈梅紅(1970-)，女，碩士生導師，主要從事針灸實驗研究。

范茜茜(1991-)，女，碩士，主要從事電針對腦缺血再灌注損傷神經保護作用的凋亡機制研究。

R245

A

1005-9202(2017)05-1041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.001