紅陽獼猴桃中葡萄座腔菌的生物學特性及致病性研究

何靖柳 - 秦 文 劉曉燕 - 李洪怡 - 沈丹丹SN -

(1. 四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2. 雅安職業技術學院，四川 雅安 625000)

紅陽獼猴桃由四川蒼溪縣龍崗山選育而成，屬世界首個紅肉型獼猴桃特優新品種[1]。課題組[2]前期研究發現，紅陽獼猴桃易出現熟(軟)腐病，并從腐爛的獼猴桃中分離出主要致病菌——葡萄座腔菌(Botryosphaeriaparva，B.parva)。Botryosphaeriaspp.是一類球狀、雙囊壁的子囊菌，不僅危害果實，對樹木的致病性也是全球性的[3-5]。中國因葡萄座腔菌科引起的樹木潰瘍類病害較多，會造成各種林木(楊樹、松樹、桉樹等)材質下降和果樹(蘋果、梨、桃等)減產[6]。據研究[7]報道山核桃的干腐病致病菌為Botryosphaeriadothidea，簡稱B.dothidea，屬子囊菌門(Ascomycota)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)。李誠等[8-9]從江西奉新縣獼猴桃果實中分離出6種致病菌，其中包括B.dothidea，但僅對葡萄座腔菌進行了鑒定，并未對葡萄座腔菌的相關生物學特性進行深入的研究。韓青梅等[10]將B.dothidea接種至蘋果果肉，研究了葡萄座腔菌侵染蘋果組織的細胞學特征，也未對致病菌的生物學特性進行全面研究；課題組[2]前期研究顯示分離出的葡萄座腔菌不產孢子，而韓青梅等[10]研究表明該菌可通過孢子進行繁殖，研究結果出現差異，因此，需進一步對其探索。Slippers等[11-12]發現逆境可誘導Botryosphaeriaspp.產孢，可通過菌落劃傷、紫外線照射、營養缺乏(碳源、氮源)等作用方式。Cunnington等[13]對維多利亞和新南威爾士園藝作物中Botryosphaeria物種多樣性進行研究，發現該致病菌主要來自病變的葡萄，少量來自核果和仁果類水果，其中最常見的致病菌是B.parva。

目前，國內外關于B.parva的研究較少，主要集中于Botryosphaeriaceae的分子學鑒定及Botryosphaeria中其他亞種引起病害的防治等方面。為了更全面地呈現B.parva的相關生物學特性，課題組將對紅陽獼猴桃中的B.parva生長特性、是否產孢子、最適生長環境、致死條件、致病性等進行研究，為明確病害的發生、發展規律提供試驗基礎，同時為相關病害的防治提供科學有效的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

Botryosphaeriaparva：由本實驗室貯藏的紅陽獼猴桃分離而得，分離方法依據柯赫氏法則[14]，鑒定，純化，保存；

寄主范圍試驗水果：購自雅安市吉選超市；

無水乙醇、乳酸、苯酚、苯胺藍、甘油、氯化鈉、戊二醛、丙酮、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素：分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子顯微鏡：Olympus CX31RTSF型，日本Olympus公司；

電熱恒溫培養箱：DNP. 9162型，上海精宏實驗設備有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ. SG41. 280型，上海華線醫用核子儀器有限公司；

高速冷凍離心機：BR4i型，美國Thermo公司；

恒溫振蕩培養箱：HZQ. X100型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

冰箱：海爾BCD-190TMPK型，海爾電器集團；

潔凈工作臺：SW-CJ-1F型，蘇凈集團安泰公司；

透射電顯微鏡：H-600型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 致病菌菌絲結構的觀察

(1) 光學顯微鏡菌絲結構的觀察：用乳酸石炭酸棉藍作為染液染色后觀察B.parva菌落形態[15]。

(2) 透射電鏡菌絲超微結構的觀察：將無菌水加入長勢良好的B.parva斜面，菌絲與無菌水混合均勻制成菌懸液，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，離心后菌絲切分成1 cm3的組織塊，用2.5%戊二醛固定2 h后，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗15 min，重復3次。用100%丙酮室溫脫水15～20 min，重復3次。用純包埋液37 ℃處理2～3 h，45 ℃烘箱內固化12 h，用超薄切片機切片，厚度為50～60 nm，3%醋酸鈾—枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察并拍照[16]。

1.2.2 致病菌生長曲線的測定 干重法測定生長曲線。將等量的致病菌菌絲分別接種至50 mL已滅菌的馬鈴薯營養液(PDB)中，于25 ℃，150 r/min培養24，36，48，60，72，84，96，108，120，144，168 h。分別搜集不同培養期的B.parva菌絲細胞，80 ℃烘至恒重后稱重，各處理重復3次，取平均值。以致病菌培養時間為橫坐標，菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 致病菌分生孢子的研究

(1) 菌落劃傷：將活化后長勢良好的B.parva菌株接種至馬鈴薯營養瓊脂培養基(PDA)，25 ℃暗培養7 d后，用無菌刀片將菌落劃傷，再培養7～28 d。每7 d對菌絲進行鏡檢觀察是否產孢，若產孢用血細胞計數板測量其產孢數量。

(2) 紫外線照射：將B.parva菌株接種至PDA平板上，于25 ℃條件下分別紫外照射6，12，24 h后全黑暗培養7～28 d。

(3) 營養缺乏：以查氏培養基為基礎培養基，測定蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖6種碳源對菌絲產孢量的影響，以不加碳源的查氏培養基為對照組；測定牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素6種氮源對致病菌菌絲產孢量的影響，以不加氮源的查氏培養基為對照組，于25 ℃暗培養7～28 d。

(4) 致病菌孢子數的測定：用血細胞培養法計數，測定致病菌的產孢數量。

1.2.4 致病菌最適生長條件 采用平板測定法[17]。將B.parva菌株接種于培養基中央，培養3～7 d后，用十字交叉法測定菌落直徑。選取可能影響菌株生長的不同溫度、pH值及光照情況和不同碳、氮源進行單因素試驗。除碳、氮源所用培養基不同外，其余各組均采用PDA培養基；除溫度和光照2組外，其他各組處理均采用25 ℃暗培養。每處理重復3次，取平均值。

(1) 溫度的影響：將B.parva菌株接種于PDA中央，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40 ℃暗培養，定期測定菌落直徑。

(2) pH的影響：將B.parva菌株接種于pH分別為4.0～10.0，以1為梯度，共7個pH的PDA中央，置于25 ℃暗培養，定期測定菌落直徑[18]。

(3) 光照的影響：將B.parva菌株接種于PDA中央，分別置于全光照、全黑暗、12 h光暗交替培養3種處理，試驗用光源為普通熒光燈(60 W)，于25 ℃培養，定期測定菌落直徑。

(4) 碳源的影響：將B.parva菌株分別接種于不加蔗糖的查氏培養基(對照組)及分別添加蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖6種碳源的培養基，于25 ℃暗培養，定期測定菌落直徑。

(5) 氮源的影響：將B.parva菌株分別接種于不加硝酸鈉的查氏培養基(對照組)及分別添加牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素6種氮源的培養基，于25 ℃暗培養，定期測定菌落直徑。

1.2.5 致病菌菌絲致死溫度的確定B.parva菌絲接種于PDB培養液，分別將錐形瓶于40，45，50，55 ℃的恒溫水浴鍋中加熱20 min，對照組不進行水浴處理[19]。水浴處理后將錐形瓶置于振動培養箱中，25 ℃恒溫黑暗振蕩(100 r/min)培養，3 d后觀察各組菌絲生長狀況。再以菌絲能夠生長的可耐受最高溫度為基礎，以每增加1 ℃為1個溫度梯度進行處理，共設5個溫度梯度，在每個處理中又設置水浴時間為5，10，15，20 min，最終確定致病菌的致死溫度及其與處理時間的關系。

1.2.6 致病菌的致病性 將B.parva菌塊(5 mm)通過有傷和無傷分別接種至健康的愛媛柑、贛南橙、檸檬、火龍果、香蕉、新疆哈密瓜、梨、蘋果、蜜棗、葡萄10種水果，設置空白對照組。觀察B.parva在不同水果上的發病情況，分離回接確認致病性。

1.3 數據處理

用Origin 8.0制圖；采用SPSS 19.0統計軟件利用鄧肯式多重比較(Duncan’s multiple range test)對差異顯著性進行分析，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 致病菌菌絲結構

由圖1可知，經乳酸石炭酸棉藍染液染色后的B.parva菌絲，在光學顯微鏡下菌絲呈明暗2種狀態，菌絲相互纏繞。高倍鏡下，菌絲呈明顯分節生長，菌絲內含橫隔膜，其將菌絲分隔成多個細胞，同時，菌絲呈分枝狀態。由圖2可知，B.parva具有完整的細胞結構，細胞壁光滑、清晰可見，細胞膜和細胞器結構完整，屬真核生物。

圖1 葡萄座腔菌菌絲圖Figure 1 Morphological characteristics of B. parva

圖2 葡萄座腔菌的透射電鏡圖Figure 2 Transmission electron microscope of B. parva (Bar=1 μm)

2.2 致病菌生長曲線的測定

由圖3可知，B.parva的生長分為3個時期，分別為延滯期(0～36 h)、對數期(36～96 h)、穩定期(96～168 h)。B.parva處于延滯期時，是把致病菌接種到新鮮培養基中，表現出細胞數目不增加，其在生長曲線上表現的特點為菌絲生長的速率常數為0；B.parva處于對數期時，細胞分裂周期短，其在生長曲線上表現的特點為生長速率常數R最大；B.parva處于穩定期時，此時的細胞數目沒有凈增加或凈減少，即正生長和負生長達到動態平衡，特點為菌絲生長的速率常數趨于0。

圖3 葡萄座腔菌的生長曲線Figure 3 Growth curve of B. parva

2.3 不同條件誘導致病菌產孢

本試驗通過菌落劃傷、紫外線照射、碳源、氮源這幾種方式誘導，從菌絲生長第7天開始連續觀察至第28天，發現菌絲均不產生分生孢子。經以上誘導試驗結果表明：B.parva與韓青梅等[10]研究的B.dothidea繁殖方式不相同，推測該種菌主要是通過菌絲進行繁殖。

2.4 致病菌最適生長條件的測定

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響 由表1可知，B.parva在溫度15～35 ℃時均能生長，在溫度低于10 ℃和高于40 ℃時菌絲不能生長。由試驗數據可知，最適宜B.parva菌絲生長溫度為30 ℃；在溫度15～30 ℃時，隨著環境溫度升高，菌落直徑不斷增大，說明菌絲在此溫度范圍內，生長速率與溫度呈正相關；但當溫度高于30 ℃時，菌絲生長速率呈現降低趨勢，生長速率與溫度呈負相關。綜上可知，B.parva屬中溫型微生物，所產生的酶在此溫度下活性最佳，在過低或過高溫度時，相關酶可能會失活或變性。

表1 溫度對菌絲生長的影響?

? 同列上標字母相同表示在0.05水平上無顯著性差異。

2.4.2 pH對菌絲生長的影響 由表2可知，B.parva在pH 4.0～10.0時均能較好生長，在pH 4.0～6.0時，菌落直徑隨著pH值的升高逐漸增大，B.parva生長速率不斷加快；當pH 6.0時菌落直徑最大，菌絲生長速率相對最高，可見pH 6.0 是菌絲生長的最適pH值；當pH 7.0～10.0時，菌落直徑差異不明顯，但均低于pH 6.0時的菌絲長度，說明高pH值不利于菌落生長。綜上所述，B.parva較適于偏酸性環境中生長。

2.4.3 碳源、氮源對菌絲生長的影響 由表3可知，致病菌在以上6種碳源上均能生長，但在不同碳源上菌絲的生長存在顯著差異。B.parva在以葡萄糖為碳源時生長最快，在蔗糖、果糖、麥芽糖為碳源時生長情況次之，以乳糖為碳源時生長最慢，但都顯著高于無碳源對照組的菌絲生長速度。綜上可知，碳源是致病菌正常生長的重要條件，但致病菌對每種碳源的吸收利用能力存在一定的差異。這取決于細胞呼吸消耗的能量直接來源物質，葡萄糖是呼吸作用中的直接供能物質，因此，葡萄糖更利于致病菌的吸收利用，而其他的碳源要被病原菌利用還必須在細胞內進行分解轉化后才行，病原菌最佳碳源為葡萄糖。

表2 pH對菌絲生長的影響?

? 同列上標字母相同表示在0.05水平上無顯著性差異。

病原菌在6種氮源上均能生長，但不同氮源間存在顯著差異。B.parva在牛肉膏上菌絲生長最好，其次為硝酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨，在尿素上生長最慢，生長速率遠遠低于其他各組，且菌落形態畸形。綜上可知，合適的氮源是病源菌正常生長的重要條件，病原菌對氮源的吸收利用能力主要取決于氮源的存在形式。有機氮化合物最易被微生物吸收利用，尤其是氨基氮；其次是無機氮化合物，如銨態氮、硝態氮和簡單的有機氮化物(尿素)；最后是空氣中分子態氮。在上述6種氮源中，牛肉膏主要以氨基酸和多肽組成，較蛋白質分子量小，更易于為病原菌提供氮源，更利于被吸收；尿素提供氮源的能力最差，推測可能由于尿素需先經微生物分解才能被利用。

表3 營養物質對菌絲生長的影響?

? 同列上標字母相同表示在0.05水平上無顯著性差異。

2.4.4 光照對菌絲生長的影響 由表4可知，在不同的光照條件下，B.parva菌絲生長速率無顯著差異，說明菌絲對光不敏感。

表4 光照對病原菌菌絲生長的影響

2.5 病原菌菌絲致死溫度的測定

由表5可知，B.parva菌絲致死溫度為42 ℃處理10 min 或43 ℃處理5 min。先在40，45，50，55 ℃的恒溫水浴鍋中處理20 min，確定B.parva的最高生長溫度為40 ℃，45 ℃及以上溫度B.parva均無法生長；再以40 ℃基礎，每增加1 ℃為一個處理，共設5個溫度處理。在每個處理中又設置5，10，15，20 min 4種時間處理，最終確定B.parva在42 ℃處理10 min或43 ℃處理5 min不能生長，即為其致死溫度。

表5 葡萄座腔菌菌絲致死溫度的測定?

? “+”表示有菌絲生長，“-”表示無菌絲生長。

2.6 病原菌的致病性

由表6、圖4和5可知，接種后第3天 10種水果均通過傷口被B.parva感染，香蕉還可通過無傷被感染，其他水果在無傷條件下均未出現發病癥狀。在供試的10種水果中，柑橘類發病癥狀相似，均表現為接種部位果皮干枯、褐變且凹陷；火龍果接種部位出現干枯與凹陷；香蕉接種部位變黑，病斑呈圓形；哈密瓜病斑呈圓形，無明顯擴散狀態；梨和蘋果接種部位出現淡褐色水漬狀斑紋；蜜棗接種部位表面凹陷，果肉呈水漬狀；葡萄接種部位明顯軟爛塌陷。將各寄主上引起病變的微生物，重新接種到PDA培養基上，培養觀察其菌落形態后，確定引起各寄主病變的微生物其菌落形態與B.parva菌落形態一致，結果表明，B.parva對各寄主具有致病性。

表6 葡萄座腔菌的寄主范圍檢測?

? “+”表示感染，“-”表示未感染。

圖4 葡萄座腔菌致病性(空白組)Figure 4 Pathogenicity of B. parva (control)

圖5 葡萄座腔菌致病性(處理組)Figure 5 Pathogenicity of B. parva (treatments)

3 結論

研究顯示，葡萄座腔菌的菌絲呈分枝狀、內含隔膜，具有完整的細胞結構；生長曲線分為3個時期，延滯期(0～36 h)、對數期(36～96 h)、穩定期(96～168 h)；經多種方式誘導該病原菌不產分生孢子，與韓青梅等[10]研究相反，是對葡萄座腔菌生物學特性研究的補充；最適生長條件為：生長溫度30 ℃，pH 6，以葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源，對光照條件不敏感；菌絲致死條件為42 ℃處理10 min或43 ℃處理5 min；葡萄座腔菌均可通過傷口對10種供試水果感染而發病，表明該病原菌具有廣譜致病性，在貯藏發病的果實時，需避免交互式感染。但葡萄座腔菌在紅陽果實上的發病機制有待進一步研究。

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