糙米酵素混菌發酵工藝優化

張旭普 - 白俊巖 - 劉騰云 - 吳榮榮 - 程書梅 -

(1. 河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2. 衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000)

糙米(Brownrice)是指除了外殼之外都保留的全谷粒，其營養及保健價值均大于精白米[1]，但由于口感較粗，蒸煮耗時，不符合現代人飲食習慣，而加工成精白米造成食物資源浪費達10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麥芽等，采用酵母等發酵而成的功能性食品基料。微生物通過本身的中間代謝，使底物產生一系列的生物化學變化，不僅改善了口感[3]，而且在保留原有營養的基礎上又通過微生物代謝產生了很多諸如γ-谷維醇[4-6]、GABA和GSH等[7-8]生理活性物質。關于糙米酵素的研究國外起步較早，日本和美國已有眾多相關發酵文獻，部分酵素產品如米乳米露等已經面世并廣泛銷往港澳臺等地[2]。中國近年已有糙米酵素的研究報道，較多學者集中探討了糙米酵素合適的發酵工藝條件，如陳庶來等[1]以還原糖消耗量為指標優化了發酵時間，酵母活化時間及添加量；張麗萍等[2]以酸度及感官評定為指標分別對配方及發酵工藝作了改進；呂美等[3]以GSH為指標確定了糙米米糠的配比、加水量、蜂蜜添加量及玉米胚油的添加量。

但傳統的糙米酵素發酵工藝存在幾點缺憾：① 原料未進行滅菌，只靠優勢菌種發酵，發酵不易控制且易染菌[9]2-3；② 處理工藝未經過糖化，很多不具有產淀粉酶的菌株不能有效利用糙米中的碳源，使得發酵不完全，發酵劑開發受限[9]3-5；③ 大部分糙米酵素的發酵采用固態或半固態發酵，相關參數不易控制[2]。本實驗室改進了以上部分工藝，利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)與本實驗室保藏的植物乳桿菌L42(Lactobacillusplantarum)混合發酵[10]，在預試驗的基礎上[11]，利用PB試驗(Plackett-Burman)[12]、最陡爬坡試驗[13-14]和響應面BB試驗(Box-Behnken)[15]對混合發酵培養基進行優化，旨在較短的發酵時間內獲得理論最大活菌數,以確保GABA與GSH等代謝產物的積累[16-17]。通過改進糖化工藝使多菌種發酵成為可能，添加滅菌工藝使純種發酵不易受影響,同時便于活菌計數排除雜菌干擾，并以活菌量作為發酵指標進行配方優化，旨在為后續的酵素生產工藝及產物測定研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；

植物乳桿菌L42：由本實驗室篩選及保藏。

1.2 材料與試劑

MRS肉湯：北京奧博星生物技術有限公司；

蛋白胨：北京雙旋微生物培養基制品廠；

酵母浸粉：英國Oxoid公司；

蜂蜜：桂林周氏順發食品有限公司；

糙米：黑龍江鶴崗市五谷農家養生坊；

大麥芽、小麥芽：煙臺市帝伯仕啤酒技術有限公司；

云南大葉種曬青毛茶葉：云南品潤有限公司；

NaCl、(NH4)2SO4：分析純，天津市福晨化學試劑廠。

1.3 培養基

YPD培養基(供釀酒酵母種子活化使用)：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；

MRS培養基(供植物乳桿菌種子活化使用)：根據瓶裝說明稱取48 g/L，加熱溶解后分裝，121 ℃高壓滅菌15 min后冷卻備用；

基礎發酵培養基：洋槐蜂蜜8 g，發芽糙米粉9 g，小麥芽粉1 g，NaCl為1 g，曬青毛茶粉0.1 g，加水至100 mL，糖化液化后經巴氏滅菌冷藏，6 h內接種。發酵液初始pH為5.8，可溶性固形物含量為11.0 °Brix。

1.4 儀器與設備

水浴恒溫振蕩器：LY20-A型，上海龍躍儀器設備有限公司；

離心機：LD5-2A型，北京京立離心機有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

生化培養箱：SPX-250B-Z型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

酸度計：PHS-25型，上海儀電科學儀器有限公司。

1.5 工藝流程及操作要點

糙米發芽處理[18-19]→干燥→粉碎(過80目篩)→培養基調配→糖化液化(升溫程序：37 ℃保溫10 min；52 ℃保溫40 min；65 ℃保溫1 h；78 ℃保溫10 min)[20-22]→冷卻→200目濾布過濾→離心取上清液(4 360×g，時間15 min)→調配→巴氏殺菌(62 ℃保溫35 min，殺菌強度約62.09 PU)[23]→冷卻→接種→發酵(12 h)→糙米酵素

1.6 可溶性固形物含量的測定

采用手持阿貝折光儀測定。

1.7 培養方法

用接種環分別挑取釀酒酵母和植物乳桿菌L42一環菌種于YPD種子培養基與MRS種子培養基的試管中，充分震蕩，在34 ℃培養箱中分別靜置培養。根據已測定的生長曲線，在10 h和15 h時分別達到對數生長期末期取出，以3 mL/100 mL(酵母約1.71×107CFU/mL，乳酸約2.15×108CFU/mL)接種量轉接到含有糙米基礎發酵培養基的三角瓶中，34 ℃恒溫振蕩培養12 h后取出，梯度稀釋涂布于MRS平板計算活菌數[24]。

1.8 試驗設計

1.8.1 PB試驗設計 在預試驗的基礎上，以7種組分即蜂蜜、糙米、小麥芽、大麥芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶作為因素，選用試驗次數N=9的試驗方法進行PB試驗設計，2個虛擬變量用于誤差估計，每個因子選取高低兩個水平，高水平是低水平的2倍。根據結果分析，選取3個主要影響因素[25]。

1.8.2 最陡爬坡試驗 根據PB試驗得到的最優一階方程，以及實際試驗情況確定3個重要影響因素的爬坡方向和步長，從而得到3個因子的最佳組合濃度范圍以逼近最大響應區域[26]。

1.8.3 響應面試驗設計(RSM) PB試驗確定了3個主要影響因素，最陡爬坡試驗確定了最大響應區域以及響應區域的中心點，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，取3個主要影響因素的3個水平，設計3因素3水平的Box-Behnken試驗[27-29]。

1.8.4 數據分析 試驗處理均包含3個平行試驗，取值為3個試驗的平均值。Plackett-Burman試驗設計和Box-Behnken試驗設計采用Design Expert.V8.0.6軟件完成。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗篩選重要影響因素

Plackett-Burman試驗因素和水平見表1。以活菌數(Y1)為響應值，試驗設計及響應值見表2。各因素的影響效果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗因素和水平

表2 Plackett-Burman試驗設計及響應值

表3 Plackett-Burman試驗各因素對活菌數的影響效果

由表3可知，該模型高度顯著(0.01蜂蜜>NaCl>大麥芽>小麥芽>茶葉>(NH4)2SO4，糙米具有極顯著影響(P<0.01)，蜂蜜和NaCl具有高度顯著效應(0.01

Y1=+3.91-0.46F1+0.59F2-0.15F3+0.29F4-0.43F5-0.023F6-0.042F7。

(1)

該方程擬合R2=0.939 1，能較好地模擬和解釋PB試驗的結果。本模型的精密度(Adeq Precision)為9.965>4，從而進一步說明該模型較為可靠。

2.2 最陡爬坡試驗逼近最大響應區域

根據PB試驗得到的最優一階方程可知，對活菌數有正效應的因素為糙米和大麥芽，說明這2個因素在高水平時混菌增殖更為有利。對活菌數有負效應的因素為蜂蜜、小麥芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶葉，說明這5個因素在低水平時對混菌增殖更為有利。各試驗因素對響應值Y1影響的顯著性順序為糙米>蜂蜜>NaCl>大麥芽>小麥芽>茶葉>(NH4)2SO4，其中糙米、蜂蜜和NaCl為顯著影響因素，糙米應在現有質量濃度上繼續增大，蜂蜜和NaCl應在現有質量濃度上繼續減少，其余因素按照其正負效應選取適當濃度，即大麥芽、小麥芽、茶葉和(NH4)2SO4質量濃度分別為0.25，0.50，0.025，0.50 g/100 mL設計最陡爬坡試驗，水平和結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗路徑設計及結果

在第5組試驗即蜂蜜、糙米、NaCl添加量分別為3.00，10.50，0.25 g/100 mL時，活菌數最大，因此選取第5組試驗中各顯著影響因子濃度作為響應面試驗的中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設計

根據Plackett-Burman試驗獲得的3個重要影響因素以及最陡爬坡試驗得到的最佳質量濃度，分別選取3個水平，以活菌數作為響應值(Y2)設計3因素3水平的Box-Behnken試驗。各因素及水平見表5，試驗設計及結果見表6。

表5 Box-Behnken試驗因素及水平

表6 Box-Behnken試驗設計及響應值

2.3.1 二次回歸模型與方差分析 通過軟件Design Expert.V8.0.6對BB試驗17組數據進行回歸分析，并經過回歸方程擬合，得到各試驗因子對響應值影響的函數表達式為：

Y2=+5.35+0.10A+0.13B-0.030C+0.11AB-0.17AC+0.22BC-0.43A2-0.37B2-0.22C2。

(2)

利用方差分析對回歸方程進行F檢驗，F值為16.52，且大于F的概率低于0.000 6，說明該方程是顯著的，模型可信度高。其中A、B、AC、BC、A2、B2、C2對響應值影響顯著，表明三因素對試驗結果的影響不是簡單的線性關系，模型的R2=0.955 0，調整后為0.897 2，說明該模型能較好地模擬和驗證試驗結果，預測擬合度Pred-R2為0.814 2，說明它與校正決定系數保持一致，能夠解釋試驗結果；變異系數C.V.%=2.56，置信度比較高；本模型精密度(Adeq Precision)=10.199>4，說明模型可以反映真實的試驗值。Box-behnken試驗方差分析見表7。

為直觀說明蜂蜜、糙米和NaCl對于混菌發酵活菌數的影響，運用軟件Design Expert.V8.0.6做出3個重要影響因子之間交互作用的響應曲面圖和等高線圖，見圖1～3。

表7 Box-Behnken試驗方差分析?

?R2為0.955 0；Adj-R2為0.897 2；Pred-R2為0.814 2。

圖1 糙米與蜂蜜對活菌數交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 1 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and honey on Y2

圖2 蜂蜜和NaCl對活菌數交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 2 The surface and contour maps of the interaction effects of honey and NaCl on Y2

圖3 糙米和NaCl對活菌數交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 3 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and NaCl on Y2

2.3.2 重要影響因素最終質量濃度的確定及結果驗證 通過Design Expert.V8.0.6分析可知蜂蜜、糙米和NaCl最佳編碼值分別為0.756，0.198，-0.260，分別對應實際值為3.38，10.71，0.24 g/100 mL，為了驗證模型準確性，采取優化后的增殖培養基即蜂蜜3.38 g/100 mL、糙米10.70 g/100 mL、NaCl 0.24 g/100 mL、小麥芽0.25 g/100 mL、大麥芽0.50 g/100 mL、(NH4)2SO40.50 g/100 mL、茶葉粉0.025 g/100 mL 進行混菌發酵12 h，含有活菌數為5.35×107CFU/mL，基本與響應面預測的活菌數(5.21×107CFU/mL)接近，是基礎糙米酵素培養基活菌數(5.71×106CFU/mL)的9.37倍。

3 結論

目前糙米酵素大多只采用酵母單菌發酵且工藝流程相對簡單，難以進行科學量化評價。本試驗在前人探究的基礎上增加了糖化和巴氏滅菌工藝，并對釀酒酵母和植物乳桿菌混合發酵作了相關研究，確定蜂蜜、糙米、NaCl、小麥芽、大麥芽、(NH4)2SO4、茶葉粉添加量分別為3.38，10.71，0.24，0.25，0.50，0.50，0.025 g/100 mL。由試驗結果可知蜂蜜、糙米和NaCl的比例和交互作用對混菌活菌數影響較大，說明合適的碳氮比，滲透壓以及生長因子的作用是酵母和植物乳桿菌發酵良好的關鍵。本研究可為混菌發酵糙米酵素提供參考，同時為發酵生產相關產品提供試驗基礎與理論依據。

但由于本試驗采用涂布平板進行菌落計數，操作繁瑣且容錯率低，后續試驗可考慮采用活菌染色后顯微鏡計數以加強試驗模型精確度；同時本試驗僅以活菌數為指標來評價酵素產品發酵工藝，對得出的產品中生理活性物質未進行研究，后續可對此進行更深入的研究，從而優化得到功能性與口感風味兼顧的平衡功能性飲料。

[1] 陳庶來, 楊小明, 劉偉民, 等. 糙米酵素發酵工藝的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(7): 275-277.

[2] 牛廣財, 朱丹, 李志江, 等. 我國糙米酵素的研究進展[J]. 中國釀造, 2010(1): 12-14.

[3] 呂美, 齊森, 賈磊, 等. 糙米酵素的發酵工藝[J]. 食品研究與開發, 2007, 28(10): 111-113.

[4] NEWMAN R K, BETSCHART A A, NEWMAN C W, et al. Effect of full-fat or defatted rice bran onserum cholesterol[J]. Plant Foods Hum Nutr, 1992, 42: 37-43.

[5] HEE S, PARK B S, LEE H G. Hypocholesterolemic action of fermented brown rice supplement in Cholesterol-fed rat Cholesterol-lowering action of fermented brown rice[J]. J Food Sci, 2005, 70(8): 527-531．

[6] HEGSTED M, WINDHAUSER S . Stabilized rice bran and oat bran lower cholesterol in human[J]. Nutrition Research, 1993, 13: 387-389.

[7] 李飛, 隋新, 蘇紅, 等. 不同發酵條件對糙米酵素中活性成分的影響[J]. 中國釀造, 2016, 35(11): 162-165.

[8] 李志江, 牛廣財, 鹿保鑫, 等. 糙米酵素發酵工藝條件的研究[J]. 中國釀造, 2008(22): 65-67.

[9] 袁周率. 糙米酵素的研發及其抗細胞凋亡作用的研究[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2015.

[10] 傅亮, 王麗麗, 田利春. 發酵型營養米乳的研制[J]. 食品與機械, 2006, 22(5): 103-105.

[11] 胡淵, 劉成國, 黃茜, 等. 干酪乳桿菌增殖培養基的優化研究[J]. 食品與機械, 2014, 30(2): 21-22.

[12] MILLE A, SITTER R. Using the folded-over 12-run plachett-burman design to consider interactions[J]. Technometrics, 2001, 43: 44-54.

[13] 韓玉潔, 謝應根, 王永華, 等. 響應面分析法優化L-乳酸發酵培養基的研究[J]. 食品與機械, 2006, 22(4): 54-56.

[14] 宋一恒, 謝定, 鐘海雁. 響應面法優化酵母富硒發酵條件[J]. 食品與機械, 2009, 25(6): 125-129.

[15] 劉麗莎, 陶國琴, 郭宏, 等. 響應面法優化豆乳鏈球菌增殖培養基[J]. 食品科學, 2014, 35(11): 124-128.

[16] 梁寶東, 魏海香, 江均平.L-乳酸細菌發酵培養基的優化[J]. 食品與機械, 2008, 24(1): 41-45.

[17] 魏敏, 張斌, 王寧寧, 等. 副干酪乳桿菌耐乳酸的馴化及增殖培養基的優化[J]. 食品與機械, 2014, 30(2): 25-30.

[18] 楊椰. 發芽糙米研發進展[J]. 糧油食品科技, 2011(3): 19-23.

[19] 金增輝. 糙米酵素及其產品開發[J]. 糧食與油脂, 2002(4): 14-16.

[20] 王志堅. 糖化工藝主要技術參數的確定[J]. 山東食品發酵, 2002(2): 41-44.

[21] 朱鳳嬌, 陳葉福, 王希彬, 等. 上面發酵高粱啤酒的工藝研究[J]. 現代食品科技, 2017, 33(9): 1-6.

[22] 管敦儀, 唐是雯. 《啤酒工業手冊(修訂版)(精)》新版發行[J]. 食品與發酵工業, 2008(8): 17.

[23] 唐建民, 王福泉, 陸培基, 等. 格瓦斯飲料的巴氏消毒效果的初步觀察[J]. 食品科學, 1983(9): 38-39.

[24] 周德慶. 微生物學教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2008: 151-152.

[25] 滕國生, 劉勇, 武麗達, 等. 響應面優化L-賴氨酸培養基[J]. 食品與機械, 2015, 31(5): 256-260.

[26] TRUPKIN S, LEVIN L, FORCHIASSIN F. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and syn-thetic dye decolorization using response surface methodology[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30: 682-690.

[27] AMBAT P, AYYANNA C. Optimizing medium constituents and fermentation conditionsfor citric acid production from palmyrajaggery using response surface method[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2001, 17: 331-335.

[28] 魯晶晶, 王遠亮, 謝夢琴. 植物乳桿菌LJ-3產細菌素的響應面優化[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 242-246.

[29] PURI S. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp.by Response Surface Methodology[J]. Current Microbiology, 2009, 4: 286-290.