聚酰胺分離純化黃櫨葉漆黃素工藝研究

徐 娜 許凱揚 - 方 芳 舒孝順 - 李赤翎 -

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

黃櫨(Cotinuscoggygriascop.)為漆樹科黃櫨屬植物，一直被用作保持水土的防護林和園林綠化的景觀植物。近代研究表明其具有抑制前列腺素生成、解痙、抗腫瘤及治療黃疸型病毒肝炎等作用[1-3]，其中，漆黃素為主要有效成分[4]，含量由葉、莖枝、根依次遞減[5]。此外，由于漆黃素化學結構式中B環上存在鄰苯二酚羥基，故也常用作抗氧化劑[6]，可用于功能性食品、藥品的開發。目前對于漆黃素的研究主要集中在提取、應用等方面[7-8]，而有關漆黃素分離純化的研究，報道較少[9]。

柱色譜技術是植物功能成分分離的常用方法，發展迅速，已經應用到生物醫藥工程等各個領域。張偉[10]、王克勤[11]、苗建武[12]等分別對聚酰胺樹脂分離山楂提取物中的總黃酮、芹菜黃酮、丹參總酚酸的工藝進行了研究。由于漆黃素富含羥基，可通過分子中的酚羥基與聚酰胺分子中的酰胺基形成氫鍵蒂合產生吸附[11]，故本試驗擬以黃櫨葉粗提物為原料，研究聚酰胺分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝條件，旨在為漆黃素的開發和利用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃櫨葉：購于河南南陽，烘干粉碎后置陰涼干燥處備用；

漆黃素標準品：西安匯林生物科技有限公司；

聚酰胺：80～100目，武漢立思捷科技有限公司；

氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇：分析純。

1.1.2 主要儀器設備

電熱鼓風干燥箱：101A-2型，天津市泰斯特儀器有限公司；

中草藥粉碎機：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

精密電子天平：FA2014型，天津天馬衡基儀器有限公司；

超聲波清洗機：SB3200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉蒸發器：RE-52型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

紫外可見分光光度計：UV-5200型，上海元析儀器有限公司；

層析柱：φ2 cm×30 cm，武漢立思捷科技有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-C型，蘇州培英實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚酰胺樹脂的預處理與回收 市售的聚酰胺用乙醇浸泡2 h，用3～4倍體積的乙醇洗至溶液透明后蒸至無殘留物。再依次用2倍體積5%的NaOH溶液、1倍體積蒸餾水、2～3倍體積10%的醋酸溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，濾取樹脂，自然晾干，備用。使用過的聚酰胺一般用5%的NaOH溶液洗滌，洗至NaOH溶液顏色很淡，然后水洗，再用10%的醋酸液洗，最后用蒸餾水洗至中性即可[13]。

1.2.2 粗提物的制備 稱取粉碎后黃櫨葉500 g，用60%的丙酮溶液(5 000 mL)超聲提取30 min，過濾，重復2次，合并濾液，濃縮至無丙酮味，冷凍干燥，測得漆黃素含量后備用。

1.2.3 漆黃素的測定 采用紫外分光光度法[14]。

(1) 標準曲線的繪制：精密稱取漆黃素標準品2.00 mg，用60%丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。精確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于10 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收峰366 nm處測定其吸光度，所得數據經回歸處理，得到標準曲線回歸方程為A=0.075 9C-0.027 3，相關系數為R2=0.999 7。

(2) 樣品漆黃素的測定：取一定量樣品，按漆黃素標準曲線測定方法測定樣品吸光度，帶入回歸方程得出濃度。

1.2.4 靜態吸附試驗

(1) 上樣量的確定：分別稱取聚酰胺0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 g，加適量的水充分膨脹后(以下均做此處理)，再分別加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL提取液20 mL，振蕩24 h后，吸取上清液測定漆黃素濃度，按式(1)和(2)計算吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式中：

X1——吸附量，mg/g；

X2——吸附率，%；

C0——初始濃度，mg/mL；

C1——吸附后濃度，mg/mL；

V——吸附液體積，mL；

W——樹脂質量，g。

(2) 吸附時間的確定：準確稱取6 g聚酰胺樹脂，加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液40 mL，振蕩，分別在0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 h取樣，測定漆黃素濃度，計算吸附量。繪制靜態吸附動力曲線圖。

(3) 洗脫劑濃度的選擇：分別稱取9份3 g聚酰胺，加入漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液20 mL，振蕩1 h后，濾出樹脂，烘干，再分別加入20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液各100 mL，振蕩2 h后，取上清液測定漆黃素濃度，按式(3)和(4)計算解析量和解析率。

(3)

(4)

式中：

J1——解析量，mg/g；

J2——解析率，%；

C2——解析液濃度，mg/mL；

V——解析液體積，mL；

W——樹脂質量，g。

1.2.5 動態吸附試驗

(1) 上樣流速的確定：取5 g聚酰胺裝入層析柱中，將3份漆黃素濃度為0.267 9 mg/mL的提取液30 mL分別以0.5，1.0，2.0 mL/min的流速通過聚酰胺柱，進行動態吸附，收集流出液，測定漆黃素濃度，計算吸附率。

(2) 樣品濃度的選擇：取5份5 g聚酰胺裝入層析柱中，分別加入漆黃素濃度為0.267 9，0.535 8，1.071 6，1.607 4，2.143 2 mg/mL的提取液30 mL，以1 mL/min的流速通過聚酰胺柱，收集流出液，測定漆黃素濃度，計算吸附率。

(3) 上樣量的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液100 mL，以1 mL/min的流速通過聚酰胺柱，收集流出液，每10 mL為一管，測定漆黃素濃度，繪制泄露曲線。

(4) 洗脫劑濃度的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通過聚酰胺柱。用水洗至無色后，分別用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進行梯度洗脫，收集洗脫液，測定漆黃素濃度。

(5) 洗脫液用量的確定：取5 g聚酰胺于層析柱中，加入漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通過聚酰胺柱。用水洗至無色后，用120 mL 體積分數為70%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，每10 mL為一管，測定漆黃素濃度，繪制洗脫曲線。

2 結果與討論

2.1 靜態吸附試驗

2.1.1 上樣量的確定 由表1可知，漆黃素量一定時，吸附率隨樹脂量的增多而增加。當漆黃素量與樹脂量的比值為1∶372 (g/g)時，吸附基本達到飽和，此時再增加樹脂量，吸附率變化較少，為節約成本，宜選擇1∶372 (g/g)為最佳上樣量。

2.1.2 吸附時間的確定 由圖1可知，吸附量在前1 h內增長較快，1～2 h變化趨于平緩,2 h后基本達到吸附平衡。這是由于吸附初期，樹脂表面與漆黃素接觸充分，而吸附后期受到孔容的限制[15]。故選擇1 h為靜態吸附時間。

表1 不同上樣量的靜態吸附測定結果

圖1 靜態吸附動力學曲線圖Figure 1 kinetics curve diagram of static adsorption

2.1.3 洗脫劑濃度的選擇 由圖2可知，解析率隨乙醇濃度的增加而增大，當乙醇濃度為60%時，解析率最大，此后再增加乙醇濃度，解析率變化不大。考慮效益和成本，宜選擇60%的乙醇為洗脫劑。

圖2 洗脫劑濃度對解析率的影響Figure 2 Effect of eluent concentration on analytical rate

2.2 動態吸附試驗

2.2.1 上樣流速的確定 由圖3可知，吸附率隨上樣流速的增加而減小，上樣流速過大，樣品未被吸附就流出樹脂柱；流速過小，試驗周期長。從吸附效果與試驗周期考慮，選擇1 mL/min 作為上樣流速。

2.2.2 樣品濃度的選擇 由圖4可知，當漆黃素濃度為0.535 8 mg/mL時，吸附率最大，若再加大樣品濃度，吸附率反而呈下降趨勢。這是由于過高的樣品濃度不利于擴散和吸附。故選擇0.535 8 mg/mL為上樣濃度。

2.2.3 上樣量的確定 由圖5可知，從40 mL開始，漆黃素開始發生泄露，當上樣量為70 mL時，流出液中漆黃素濃度達到0.404 7 mg/mL，接近進樣濃度。故選擇40 mL為最大上樣量，約為2 BV。換算成漆黃素與樹脂量的比值約為1∶233 (g/g)，與靜態吸附上樣量1∶372 (g/g)相比，動態吸附效率較高。

圖3 上樣流速對吸附率的影響Figure 3 Effect of sample velocity on adsorption rate

圖4 樣品濃度對吸附率的影響Figure 4 Effect of sample concentration on adsorption rate

圖5 泄露曲線圖Figure 5 Leakage curve

2.2.4 洗脫劑濃度的確定 由表2可知，10%，30%，50%，70%乙醇洗脫混合物漆黃素占全部洗脫所得漆黃素量的97%，已洗脫出漆黃素的絕大部分，殘留的漆黃素量較少，從經濟方面考慮，宜選擇70%乙醇作為洗脫劑。

2.2.5 洗脫液用量的確定 由圖6可知，漆黃素含量隨洗脫液用量的增加而增加，第8收集管漆黃素濃度較低，此時，可以認為絕大部分漆黃素已被洗脫下來。故選擇80 mL作為最適洗脫量，約為4 BV。

表2 不同濃度乙醇洗脫混合后漆黃素含量

圖6 洗脫曲線圖Figure 6 Elution curve diagram

2.3 精制次數對漆黃素純度的影響

將黃櫨葉粗提物配置成濃度為0.535 8 mg/mL的溶液，以2 BV為上樣量，1 mL/min的流速通過80～100目的聚酰胺柱，吸附完成后，水洗至無色，然后用4 BV體積分數為70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至無乙醇味，冷凍干燥，計算純化物中漆黃素的質量分數，重復精制3次。

表3 精制次數對漆黃素純度的影響

由表3可知，黃櫨葉粗提物經過聚酰胺樹脂的3次吸附和解吸后漆黃素含量由粗品的10.30%升高到了79.82%，純度提高了6.75倍。

3 結論

樹脂法具有工藝簡單，成本低廉，無有害殘留物等優點，廣泛應用于有效成分的分離與純化。而聚酰胺可通過分子中的酰胺羰基與黃酮類化合物中的酚羥基形成氫鍵蒂合而產生吸附作用，故聚酰胺是分離純化黃酮類化合物較好的吸附劑。本試驗考察了聚酰胺分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝，確定了最佳條件：上樣流速1 mL/min，樣品濃度0.535 8 mg/mL，上樣量2 BV，洗脫劑為70%的乙醇，洗脫劑用量4 BV，在此工

藝條件下，黃櫨葉粗提物經聚酰胺樹脂精制3次后漆黃素純度提高了6.75倍，表明此分離純化方法可行。但本試驗僅對聚酰樹脂分離純化黃櫨葉漆黃素的工藝條件進行了單因素試驗，在此基礎上對純化條件進一步優化，可通過正交或響應面試驗探究各影響因素之間關系，為下一步提純工藝提供參考。

[1] 王繼紅. 從木臘樹中提取非瑟酮的研究[J]. 實驗室科學, 2012, 15(6): 87-89.

[2] 廖洪利, 吳也, 臧志和. 漆黃素抗腫瘤作用研究進展[J]. 天津藥學, 2013, 25(6): 44-46.

[3] 李建華, 段丹丹, 馬聰玲, 等. 黃櫨有效成分漆黃素提取工藝研究[J]. 中華中醫藥雜志, 2012, 27(7): 1 956-1 958.

[4] 陶峰, 顏仁杰, 周海鳳, 等. 黃櫨化學成分與藥理活性研究進展[J]. 世界臨床藥物, 2014, 35(2): 109-112.

[5] 王俊杰, 江善青, 王剛, 等. 黃櫨植物化學成分、藥理作用與臨床應用研究進展[J]. 國際中醫中藥雜志, 2015, 37(3): 283-285.

[6] 陳興玉, 李萍, 張昌華, 等. 漆黃素與酸、堿、鹽反應的動態紫外吸收光譜[J]. 光散射學報, 2013, 25(4): 429-432.

[7] 陳虹霞, 王成章. 漆樹黃酮類化合物研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2013, 25(12): 1 752-1 758.

[8] 劉東鋒, 李法慶, 楊成東. 一種漆黃素的提取方法: 中國, 201010500143.0[P]. 2010-10-09.

[9] 龍麗輝, 郭增軍. 黃櫨中漆黃素提取工藝及含量測定方法的研究進展[J]. 中華臨床醫學研究雜志, 2006，12(21): 2 937-2 938.

[10] 張偉, 葛志強, 蔣建蘭. 聚酰胺樹脂分離純化復方山楂提取物中總黃酮的研究[J]. 中草藥, 2009, 40(1): 63-66.

[11] 王克勤, 嚴志慧, 羅軍武, 等. 聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J]. 食品與機械, 2009, 25(3): 46-50.

[12] 苗建武, 陳紹民, 王超, 等. 聚酰胺樹脂分離純化丹參總酚酸的研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(3): 28-30.

[13] 周林. 桑枝黃酮提取分離及抗氧化活性研究[D]. 重慶: 西南大學, 2011: 30.

[14] 申慶亮, 李建華, 于盛茂, 等. 紫外分光光度法測定黃櫨糖漿中漆黃素含量[J]. 中國中藥雜志, 1990, 15(7): 40-41.

[15] 董江濤. 柿黃酮的提取、純化及抗氧化性研究[D]. 上海: 上海海洋大學, 2010: 43.