臭氧、電子束輻照降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

羅小虎 - 李 克 王 韌 邢家溧 - 王 莉 杜志紅 - 潘麗紅 - 孫冬玲 -ng 李亞男 - 陳正行 -

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學糧食發酵工藝與技術 國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122； 4. 寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江 寧波 315048；5. 無錫愛邦輻照技術有限公司，江蘇 無錫 214151)

真菌毒素污染是全球性問題，每年由此造成了巨大的經濟損失。在中國，相當大的地區處于溫帶和亞熱帶，為產毒真菌的生長繁殖帶來了適宜的氣候條件[1]。目前已發現的400余種真菌毒素中，來源于鐮孢屬菌種的玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)[2]和來源于曲霉屬和青霉屬真菌的赭曲霉毒素(OchratoxinA，OTA)[3]，ZEN、OTA分布范圍極廣且毒性較強[4-6]。

臭氧是一種強氧化劑，在液體體系中，能以分子和自由基2種作用方式攻擊有機物中的雙鍵[7]，且臭氧具有良好的滲透性，并能自動分解為氧氣，無任何毒性殘留物產生。因此，臭氧作為一項極具潛力的真菌毒素消減技術，近10年來對其進行了大量研究。羅小虎等[8]研究了臭氧降解黃曲霉毒素B1污染玉米在小鼠體內的毒性，結果表明，臭氧處理后的污染玉米可顯著改善小鼠多項生理、生化指標，證明了該項技術的安全性；Zorlugenc等[9]分別采用臭氧氣體和臭氧水對干無花果中的AFB1進行處理，當臭氧氣體和臭氧水中臭氧濃度分別為13.8，1.71 mg/L，處理時間為180 min時，樣品中AFB1降解率分別為95.21%，88.62%。

電子束輻照技術是利用電子加速器產生的電子束，對產品進行輻照，該技術具有能量利用率高、操作簡單、使用安全等突出優勢，是一項安全有效的綠色加工技術。自20世紀90年代以來，研究者們對其在農產品和食品貯藏、作物育種、輻射化工、輻射殺菌殺蟲等領域進行了大量探索[10-12]。近年來，研究者在利用電子束輻照降解真菌毒素方面進行了一些探索。羅小虎等[13]研究了電子束輻照對玉米AFB1的降解效果，結果表明，電子束劑量在0～50 kGy時，可以有效降解玉米中AFB1，當電子束劑量達50 kGy時，AFB1降解率高于90%，其作用機理與γ射線相似[14]，即水分子經電子束輻照后被激發、電離，產生羥自由基和水合電子等，羥自由基進一步破壞毒素分子結構。

當前，臭氧和電子束輻照對ZEN和OTA降解的理論和應用研究較少[15]，這為了解臭氧、電子束輻照降解食品中ZEN和OTA的效果形成了局限。本研究擬基于前人在臭氧降解嘔吐毒素(Deoxynivalenol，DON)[16]、AFB1[17]、OTA、ZEN[15]，以及電子束輻照降解AFB1的基礎上，分別采用乙腈和甲醇溶劑體系，研究臭氧濃度、樣品濃度、處理時間和輻照劑量等因素對ZEN和OTA降解率的影響，最終為臭氧和電子束輻照降解食品中OTA和ZEN的污染提供理論基礎和實踐依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

ZEN和OTA標準品：純度≥99.8%，百靈威科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

乙酸：色譜純，百靈威科技有限公司；

實驗用超純水：電阻≥18.2 MΩ/cm，Millipore-QSP超純水儀制備；

氮氣(純度≥99.8%)、氧氣(純度≥99.8%)：無錫新南化學氣體有限公司；

其他試劑：分析純，國藥化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

帶熒光檢測器：HPLC 1260型，美國安捷倫公司；

色譜柱：ZORBAX SB C18型，美國安捷倫公司；

電子束加速設備：AB5.0型，無錫愛邦輻照科技有限公司；

臭氧發生器：CFG-3-20 g型，青島國林實業股份有限公司；

臭氧濃度分析記錄儀：Ideal 2000型，中國淄博愛迪爾測量控制有限公司；

氮吹儀：MD200-1型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ZEN和OTA標準儲備液和工作液的配制 將ZEN溶于甲醇溶液，OTA溶于乙腈溶液，分別配備成100 μg/mL和10 μg/mL標準儲備液，-20 ℃保藏。取一定量ZEN標準儲備液，氮氣吹干，再分別加入甲醇和乙腈復溶，配置成0.5，1.0，2.0，5.0 μg/mL的ZEN/甲醇(ZEN/Met)和ZEN/乙腈(ZEN/Ace)的標準工作液，4 ℃保藏，待電子束輻照處理；取一定量ZEN標準儲備液，用甲醇配置成50 μg/mL的標準工作液，4 ℃保藏，待臭氧處理。取一定量OTA標準儲備液，氮氣吹干，再分別加入甲醇和乙腈復溶，配置成0.1，0.2，0.5，1.0 μg/mL的OTA/甲醇(OTA/Met)和OTA/乙腈(OTA/Ace)標準工作液，4 ℃保藏，待電子束輻照處理；取一定量OTA標準儲備液用乙腈配制成5 μg/mL的工作溶液，4 ℃保藏，待臭氧處理。

1.2.2 ZEN和OTA含量的測定 高效液相色譜儀：帶G1312B熒光檢測器，Agilent 1260型。色譜柱：ZORBAX SB C18柱，4.6×150 mm，填料直徑5 μm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。ZEN流動相：甲醇/水(體積比60/40)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：激發波長274 nm，發射波長440 nm。OTA流動相：水/乙腈/乙酸(體積比56/43/1)，流速：0.9 mL/min；檢測波長：激發波長333 nm，發射波長477 nm。

1.2.4 臭氧降解ZEN和OTA 分別取2 mL ZEN(50 μg/mL)和OTA(5 μg/mL)工作液于10 mL聚乙烯離心管，通入臭氧。臭氧處理ZEN條件：濃度2.0 mg/L，流速1.0 L/min，處理時間為0，1，2，3，5，10 s；臭氧處理OTA條件：濃度50.0 mg/L，流速1.0 L/min，處理時間為0，10，30，60，90，120，180 s。臭氧處理結束后，通氮氣3 min終止反應，隨后用1 mL流動相復溶，待測。

1.2.5 電子束輻照降解ZEN和OTA 分別取2 mL的ZEN和OTA電子束輻照工作液于5 mL聚乙烯離心管，輻照劑量分別為0，3，6，9，12 kGy，加速電子能量5 MeV，束流20 mA，劑量率2 kGy/s。樣品輻照后氮氣吹干，1 mL流動相復溶，待測。

1.2.6 數據處理 本試驗樣品處理和檢測至少重復3次，采用SPSS17.0數據分析軟件進行單因素方差分析，當P<0.05時，認為數據在統計學上具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

由圖1、2可見，ZEN和OTA濃度分別在0.5～5.0 μg/mL 和0.1～1.0 μg/mL時，其峰面積與濃度呈線性相關性。以峰面積(mAU)為縱坐標(Y)，進樣濃度(μg/mL)為橫坐標(X)制作標準曲線，得ZEN標準曲線回歸方程為Y=3.223 3X+0.066，R2=0.999 8，OTA標準曲線回歸方程為Y=140.51X+0.502 3，R2=0.999 6。

2.2 臭氧和電子束輻照降解ZEN

2.2.1 臭氧對ZEN降解率的影響 圖3顯示的是2 mL 50 μg/mL 的ZEN標準工作液在不同的臭氧處理時間下的降解率。當處理時間為1 s時，ZEN的降解率超過50%，隨處理時間的延長，ZEN的降解速率逐漸減緩，當處理時間達10 s 時，溶液中未檢出ZEN。

ZEN分子中C10—C11為烯烴雙鍵結構，是臭氧分子的主要反應位點[18]。此外，研究表明芳香族有機物中苯環上含酚羥基結構有助于臭氧等氧化物反應破壞[19]，ZEN分子中苯環結構含2個酚羥基，且空間位阻作用小，可能是導致在低臭氧濃度和較短反應時間條件下，ZEN即被降解完全的原因。

圖1 ZEN的HPLC標準曲線Figure 1 Standard curve of zearalenone solution

圖2 OTA的HPLC標準曲線Figure 2 Standard curve of ochratoxin A solution

圖3 不同臭氧處理時間下ZEN的降解效果Figure 3 Degradation curve of ZEN by ozone at different treat time

2.2.2 電子束輻照對ZEN的降解效果

“一帶一路”背景下珠三角企業的外籍人才需求研究——基于廣深佛三市314家企業問卷數據的分析………………何展鴻(29)

(1) 輻照劑量對ZEN的降解效果：圖4顯示的是2.0 μg/mL 的ZEN標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。從圖4中可以看出，在0～6 kGy劑量條件下，ZEN降解速率隨輻照劑量的增加呈加快趨勢，6 kGy時，ZEN降解率超過50%；在6～9 kGy的劑量條件下，隨輻照劑量的增加，ZEN降解率增速減緩，12 kGy條件下，ZEN降解率達到86%。

圖4 輻照劑量對溶液中ZEN的降解效果Figure 4 Degradation curve of ZEN solution at different EB irradiation doses

現有研究表明，電子束輻照技術在真菌毒素降解中具有獨特的優勢，并取得了良好的成果。Liu等[20]采用電子束輻照處理水溶液中的AFB1，8 kGy劑量下1，5 μg/mL的毒素樣品均被降解完全；Peng等[21]采用電子束輻照技術對不同溶劑體系中的OTA進行了輻照處理，發現相同濃度下OTA的降解率：水>乙腈>甲醇-水(體積比60∶40)。本研究結果表明，電子束輻照技術對甲醇溶液中的ZEN同樣具有良好的降解效果。

(2) 樣品濃度對ZEN的降解效果：圖5顯示的是不同濃度的ZEN標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。由圖5 可知，在0.5～5.0 μg/mL濃度范圍內，ZEN濃度的增加對ZEN的降解率無明顯影響。該結果與相同輻照劑量和ZEN濃度下Luo等[22]的研究結果相似，然而ZEN濃度更高，ZEN降解率下降，可能是ZEN濃度為20 μg/mL時，相同劑量下，單位質量毒素的輻照吸收量過低，限制了溶液中自由基的反應，從而導致降解率下降。

圖5 樣品濃度對溶液中ZEN的降解效果Figure 5 Degradation curve of ZEN solution at different concentrations

(3) 溶劑對ZEN降解效果：圖6顯示的是將相同濃度梯度的ZEN標準工作液氮吹至干，采用等體積乙腈復溶后進行電子束輻照，考察其對ZEN降解效果的影響。由圖6可知，在0～6 kGy輻照劑量下，ZEN在乙腈溶液中的降解速率明顯快于標準工作液，即ZEN在乙腈溶液中，3 kGy劑量下，ZEN降解率即超過50%，而達到相同降解率的ZEN甲醇溶液所需劑量為6 kGy；在6～12 kGy劑量下，ZEN在2種溶液體系中降解速率均減緩，沒有顯著區別。

圖6 溶劑對溶液中ZEN的降解效果Figure 6 Degradation curve of ZEN at different solution

Schmelling等[23]的研究結果表明，電子束輻照有機溶劑體系[乙腈和甲醇-水(體積比60∶40)]中產生的自由基數量較少，且甲醇為自由基清除劑[24]，自由基處于產生-湮滅的動態過程。在0～6 kGy的輻照劑量下，由于乙腈溶液體系中輻照產生自由基隨即與ZEN分子反應，而甲醇體系中生成的自由基伴隨著甲醇分子的消除，因此降低了ZEN在甲醇溶液中的降解速率；6～12 kGy劑量下，乙腈和甲醇體系中ZEN降解速率均減緩，原因可能是在更高劑量下，溶劑中自由基增加數量有限，進一步限制了降解速率。

2.3 臭氧和電子束輻照降解OTA

2.3.1 臭氧對OTA的降解效果 圖7顯示的是2 mL 5 μg/mL 的OTA標準工作液在50 mg/L，流速為1 L/min，不同時間的臭氧處理對OTA降解率的影響。當臭氧處理時間為10 s時，OTA的降解速率最快，隨后逐漸降低，30 s時OTA降解率達最大值(22%)，30～180 s時，OTA降解率趨于平緩，無明顯變化。推測可能是在本試驗的強氧化條件下，乙腈分子發生聚合反應，形成共軛體系，對毒素分子形成保護作用，因而限制了降解率的進一步增加。此外，OTA分子較為復雜的分子結構，造成的較大空間位阻效應，也是限制反應的因素。

圖7 OTA在不同臭氧處理時間下的降解效果Figure 7 Degradation curve of OTA by ozone at different treat time

2.3.2 電子束輻照對OTA的降解效果

(1) 輻照劑量對OTA的降解效果：圖8顯示為0.5 μg/mL 的OTA標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。0～3 kGy劑量下，OTA降解速率最快，3 kGy時降解率即超過60%，隨后隨著輻照劑量的增加，OTA降解速率逐漸降低，但降解率始終呈升高趨勢，12 kGy時，OTA降解率達93.35%。該結果表明，電子束輻照對OTA具有良好的降解效果，具有廣闊的應用前景。

(2) OTA初始濃度對降解效果的影響：圖9顯示的是不同初始濃度的OTA標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。由圖9可知，在0.1～1.0 μg/mL濃度范圍內，OTA濃度的增加對OTA的降解率無明顯影響。Peng等[21]研究了初始OTA濃度下電子束輻照降解效果，發現在水溶液中，0.1，0.2，20.0 mg/L OTA濃度下，達到90%降解率所需的輻照劑量分別為2.19，3.93，6.66 kGy。本研究采用有機溶劑體系，因此相同OTA濃度下，降解率低于前人研究。此外，由于本試驗選用OTA樣品濃度較小，也造成不同初始濃度的OTA降解效果無顯著差別。

圖8 輻照劑量對溶液中OTA降解效果的影響Figure 8 Degradation curve of OTA solution at different EB irradiation doses

圖9 初始濃度對溶液中OTA的降解效果Figure 9 Degradation curve of OTA solution at different initial concentrations

(3) 溶劑對降解效果的影響：圖10顯示的是將相同濃度梯度的OTA標準工作液氮吹至干，采用等體積甲醇復溶后進行電子束輻照，考察其對OTA降解效果的影響。由圖10可知，在0～6 kGy輻照劑量下，OTA在甲醇溶液中的降解速率明顯低于在標準工作液中，即OTA在乙腈溶液中，3 kGy 劑量下，OTA降解率即超過60%，而達到相同降解率的OTA甲醇溶液所需劑量為6 kGy；在6～12 kGy劑量下，OTA降解速率均逐漸減緩，12 kGy時甲醇溶液中OTA降解率達到87%，低于乙腈溶液中OTA 93%的降解率。

從結果可知，乙腈溶劑體系更有利于OTA的快速降解。原因與ZEN相同，一方面，甲醇溶劑對自由基和水合電子的捕獲作用降低了電子束輻照OTA分子產生的自由基量；另一方面，較高的輻照劑量下溶劑中生成的自由基量有限，不足以推動反應的快速進行，從而限制了OTA分子的降解。

圖10 溶劑體系對溶液中OTA的降解效果Figure 10 Degradation curve of OTA at different solution

3 結論

本研究采用不同濃度臭氧以及不同處理時間，分別對高濃度ZEN和相對低濃度的OTA標準溶液進行處理，結果臭氧氣體對ZEN的降解效果極佳，而在更高臭氧濃度和較長處理時間下，OTA降解率仍難以達到預期效果；采用0，3，6，9，12 kGy電子束輻照劑量，對甲醇和乙腈溶液中ZEN和OTA進行輻照，發現電子束輻照對ZEN和OTA均具有良好的降解效果，且毒素在乙腈中降解效果更佳。臭氧降解ZEN的效果優于電子束輻照，而電子束輻照對OTA具有更好的降解效果。本研究為今后臭氧或電子束輻照降解ZEN和OTA污染食品提供了參考依據。今后需進一步研究臭氧和電子束輻照對ZEN和OTA降解效果差異的原因。

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