白及萃取物的抑菌活性及其二氯甲烷萃取物化學(xué)成分分析

吳永祥 - 程滿(mǎn)懷 - 江海濤 - 侯書(shū)增 - 萬(wàn)志兵 -

(1. 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2. 黃山學(xué)院分析測(cè)試中心，安徽 黃山 245041)

白及 [Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.] 又名白根、紫蘭、地螺絲等，為蘭科植物白及的干燥塊莖。白及廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域，主產(chǎn)于安徽、浙江、江蘇、云南、四川等地，有很高的藥用價(jià)值，具有補(bǔ)肺、收斂止血、消腫、生肌等功效，可用于治療肺傷咳血、瘡瘍腫毒、外科創(chuàng)傷、胃及消化道潰瘍疼痛等癥狀[1-2]。現(xiàn)代藥理研究表明：白及的主要化學(xué)成分是聯(lián)芐類(lèi)[3]、菲類(lèi)及其衍生物[3]、多酚類(lèi)[4]、黃酮類(lèi)[5]、多糖[6]等，具有抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗炎癥[5]、抑制酪氨酸酶[10]及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[11]等作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)白及的研究主要集中在多糖及其抗氧化方面[6-7,9]，對(duì)白及不同極性萃取物抑菌活性的研究仍然缺乏，關(guān)于白及活性成分分離與化學(xué)成分分析的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

隨著對(duì)羥基苯甲酸丙酯 (Propylparaben, PP)、苯甲酸、苯甲酸鈉鹽等食品防腐劑在食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用，雖然在抑制微生物生長(zhǎng)，防止食品品質(zhì)劣變等方面有顯著效果，但是這些人工合成的防腐劑對(duì)人體存在著潛在的危害，甚至引發(fā)癌癥[12-13]。研究開(kāi)發(fā)安全、高效、天然抑菌劑的形勢(shì)日趨緊迫。本研究以白及為原料，采用甲醇回流提取，并依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水對(duì)其進(jìn)行萃取，得到5種不同極性萃取物，探討各萃取物的抑菌效果，采用GC-MS研究抑菌活性最顯著萃取物的化學(xué)成分，挖掘白及作為新的抗菌藥物的開(kāi)發(fā)潛力，旨在為其在食品和藥品方面的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白及：2016年10月于安徽省黃山市祁門(mén)縣采集；

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)：武漢大學(xué)微生物保藏中心；

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等生物試劑：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；

二甲基亞砜、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent HP7890-5975C型，美國(guó)Agilent公司；

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：SpectraMax-190型，美國(guó)Molecular Devices公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV341型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

超純水儀：Sartorius arium comfort II型，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；

超凈工作臺(tái)：DL-CJ-1N型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：YM50Z型，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白及各萃取物的制備 將新鮮白及洗凈晾干，于60 ℃ 烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩，得白及粉末。稱(chēng)取白及粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)加入甲醇，60 ℃恒溫回流提取3 h，重復(fù)3次，抽濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到白及甲醇提取物。將甲醇提取物以1∶10 (g/mL)混懸于蒸餾水中，依次用等體積正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥得到正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水層剩余物。準(zhǔn)確稱(chēng)取上述樣品，用二甲基亞砜溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化與菌懸液制備 將受試菌接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。取活化好的菌種用生理鹽水配置成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液[14-15]，振蕩搖勻，4 ℃保存待用。

1.2.3 濾紙片法測(cè)定各萃取物的抑菌作用 在超凈工作臺(tái)中，將滅菌好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后，吸取制備好的菌懸液100 μL于培養(yǎng)皿上，均勻涂布。用移液槍于無(wú)菌直徑6 mm的濾紙片中央加入10 μL濃度為10 mg/mL的白及各萃取物，以二甲基亞砜為空白對(duì)照組 (control)，以對(duì)羥基苯甲酸丙酯為陽(yáng)性對(duì)照組 (positive control, PP)。將處理好的培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑(mm)，結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 最小抑菌濃度測(cè)定 將白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物分別配制成2，5，10，15，20 mg/mL不同濃度的樣品溶液，然后參照文獻(xiàn)[16～17]的方法，觀察各平板抑菌圈的有無(wú)，首次出現(xiàn)抑菌圈所對(duì)應(yīng)的二氯甲烷萃取物的濃度即為MIC。

1.2.5 GC-MS化學(xué)成分分析 色譜條件：色譜柱為HP-5 MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 的彈性石英毛細(xì)管柱；色譜柱初始溫度60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣 (99.999%)，載氣流速1.0 mL/min；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.5 μL。 質(zhì)譜條件：離子源為EI，離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～450 amu；采用NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，利用Duncan’s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，P<0.05認(rèn)為樣本間具有顯著性差異。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及不同極性萃取物的抑菌效果

由表1可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物無(wú)明顯抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用，以二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著(P<0.05)。當(dāng)二氯甲烷萃取物濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌 (13.00±0.71) mm，金黃色葡萄球菌 (10.13±0.48) mm，枯草芽孢桿菌 (12.75±0.50) mm，綠膿桿菌 (12.88±0.25) mm。 陽(yáng)性對(duì)照組PP 在濃度為1 mg/mL條件下，對(duì)受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌 (11.50±0.82) mm，金黃色葡萄球菌 (11.13±0.48) mm，枯草芽孢桿菌 (12.38±0.25) mm，綠膿桿菌 (12.00±0.71) mm。由此可知，二氯甲烷萃取物和陽(yáng)性對(duì)照PP對(duì)4種受試菌均具有顯著的抑制作用，其中白及二氯甲烷萃取物對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

表1 白及不同極性萃取物對(duì)4種菌的抑菌圈直徑?

? 萃取物濃度為10 mg/mL；同列不同上標(biāo)字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

2.2 白及活性萃取物的最小抑菌濃度

為了定量研究白及活性萃取物對(duì)食品中常用菌的抑制效果，本試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了其最小抑菌濃度(MIC)，其中不同濃度的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對(duì)4種受試菌的抑制效果見(jiàn)圖1。由圖1可知，白及活性萃取物對(duì)4種受試菌的抑菌圈直徑與濃度呈顯著正相關(guān)，在2～20 mg/mL 時(shí)，二氯甲烷萃取物對(duì)綠膿桿菌的抑菌圈直徑分別為 (10.88±0.48)，(12.13±1.31)，(12.88±0.25)，(13.75±0.65)，(14.00±0.41) mm。白及甲醇提取物對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC為2 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC為5 mg/mL；正己烷萃取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC為2 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5 mg/mL；二氯甲烷萃取物對(duì)4種受試菌的MIC均為2 mg/mL。表明白及活性萃取物抑菌作用排序?yàn)槎燃淄檩腿∥?正己烷萃取物>甲醇提取物。

2.3 白及二氯甲烷萃取物化學(xué)成分的GC-MS分析

采用GC-MS對(duì)白及不同極性萃取物中抑菌作用最顯著的二氯甲烷萃取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，得到二氯甲烷萃取物化學(xué)成分的總離子流圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。各組分峰用NIST08質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，從二氯甲烷萃取物中共鑒定出11種化合物，占總峰面積量的94.16%。鑒定匹配度高于80%的化學(xué)成分，按峰面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表2。二氯甲烷萃取物含有芳香族、酯、酮、有機(jī)酸、醇類(lèi)等多種成分，以芳香族、酯、酮、有機(jī)酸類(lèi)為主，其中含有4種芳香族化合物(42.85%)、3種酯類(lèi)化合物(35.11%)、2種酮類(lèi)化合物(11.70%)、1種有機(jī)酸(3.86%)。二氯甲烷萃取物中含量較高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香蘭酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二異辛酯(7.34%) 和亞油酸(3.86%) 等。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)以上試驗(yàn)可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物無(wú)明顯抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌和綠膿桿菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著萃取物濃度的增加，其抑菌作用不斷增強(qiáng)。二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著，其對(duì)4種受試菌的最小抑制濃度均為2 mg/mL。GC-MS分析結(jié)果顯示，二氯甲烷萃取物的主要化學(xué)成分以芳香族、酯、酮、有機(jī)酸類(lèi)化合物為主，其中含量較高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香蘭酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二異辛酯(7.34%) 和亞油酸(3.86%) 等。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)高香蘭酸乙酯、亞油酸等化合物能夠有效地抑制微生物的生長(zhǎng)。二氯甲烷萃取物中高含量的芳香族、酯、有機(jī)酸類(lèi)化合物可能是其抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[20-21]，但未知的是哪種或哪幾種成分發(fā)揮主要作用，需進(jìn)一步分離純化，以篩選出更加明確有效的抑菌活性成分。本研究表明白及二氯甲烷萃取物有一定的藥學(xué)研究?jī)r(jià)值和作為天然食品防腐抑菌劑的潛能。

圖1 白及活性萃取物對(duì)4種菌的抑菌圈直徑

Figure 1 Diameter of inhibitory zone of active fractions ofB.striataagainst four common bacterial strains

圖2 白及二氯甲烷萃取物的GC-MS總離子流圖Figure 2 Total ion chromatogram of dichloromethane fraction of B.striata表2 白及二氯甲烷萃取物的化學(xué)成分及其相對(duì)含量

Table 2 Chemical constituents and relative contents of dichloromethane fraction ofB.striata

序號(hào)保留時(shí)間/min化合物相對(duì)含量/%130．62832，4?二叔丁基苯酚0．27235．1579β?桉葉醇0．64346．8272亞油酸3．86449．80554?甲氧基苯基磷酸二乙酯2．52550．8899高香蘭酸乙酯25．25651．50734?乙基?2?甲氧基苯酚1．75753．39082?甲基?3，4?苯并菲39．97854．09133?甲基?3，4?苯并菲0．86954．3715反式?4′?氟?4?甲硫基查耳酮9．441055．8865癸二酸二異辛酯7．341156．34835，6，7，8?四氫?2?甲氧基?5，5?二甲基蒽?1，4?二酮2．26

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