桉葉精油氣相擴散抑菌活性及抑菌成分研究

任小玲 - 岳淑麗 - 向 紅 劉薈雅 -

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物的總稱，原產于澳大利亞，在全世界上百個國家和地區均有種植[1]。桉樹自1890年引入中國，目前在中國的種植面積已超過3.60×106hm2[2]。從桉樹葉中提取的桉葉精油具有廣譜抑菌、抗氧化、消炎、抗病毒及殺蟲驅蚊等作用，其主要有效成分為酚類、黃酮類、皂甙、萜類等[3-5]。桉葉精油因其廣譜抑菌性而廣泛應用于食品、醫藥等行業，但桉葉精油易揮發，難以長時間發揮抑菌作用[6-8]。微膠囊技術可使桉葉精油微膠囊化，利用微膠囊壁材的控釋性，可實現桉葉精油長效抑菌[9]。將精油微膠囊應用到氣調保鮮中，在保鮮的同時還可抑制有害微生物的生長，但微膠囊化后的桉葉精油只能以氣態分子形式揮發到空間中。目前，國內外對桉葉精油抑菌方式的研究主要集中在液相擴散和固相擴散[3-5,10-13]，對氣相擴散抑菌方式的研究尚不多見。在桉葉精油添加量相同的情況下，氣相、液相和固相擴散3種抑菌方式何種方式抑菌效果更好，尚無研究。

本試驗擬以抑菌圈直徑和最低抑菌濃度(MIC)為指標，將氣相擴散抑菌效果與液相和固相進行對比，探究桉葉精油的氣相擴散抑菌活性，并結合SPME/GC-MS測試結果，分析氣態桉葉精油主要成分及主要抑菌成分，以期為桉葉精油在氣調保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

桉葉精油：廣州市帕塞佳香精香料有限公司；

營養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉：華南農業大學食品學院生物工程實驗室提供。

1.1.2 主要儀器設備

超凈工作臺：SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

生化培養箱：LRH-250-Ⅱ型，廣東省醫療器械廠；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：SYQ-DSX-280B型，上海申安醫療器械廠；

搖床培養箱：ZWY-100H型，廣州市綠向生物科技有限公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：GC-MS 7890B-5977A型，安捷倫科技有限公司；

手動SPME進樣器：57324-U型，萃取纖維頭為100 μL PDMS，美國Supelco公司。

1.2 方法

為對比桉葉精油在氣相擴散(濾紙片法、平板法)方式下的抑菌效果(通過抑菌圈和MIC進行判定)，本試驗同時進行液相擴散(平板打孔法、試管二倍稀釋法)和固相擴散(濾紙片法、平板稀釋法)抑菌試驗。

1.2.1 菌懸液的制備 用固體斜面培養基對供試菌進行活化，細菌采用平板計數法，霉菌采用顯微鏡直接計數法測菌體個數。根據計數結果，制成菌體濃度為106～107CFU/mL的均勻菌懸液，備用[14]。

1.2.2 含菌平板的制備 無菌條件下，向培養皿倒入20 mL冷卻至45 ℃左右的培養基，待培養基自然冷卻凝固后，滴入上述菌懸液100 μL，均勻涂布，靜置待菌液被吸收即成含菌平板，備用。

1.2.3 精油氣相擴散抑菌試驗

(1) 抑菌圈的測定：采用濾紙片法[15]。無菌條件下，直徑6 mm的無菌濾紙片貼于含菌平板的皿蓋內中央，每皿蓋中央放1片濾紙片，并使之展開，向濾紙片滴加桉葉精油，桉葉精油添加量依次為5，10，25 μL，以添加無菌水的濾紙片為空白對照，培養皿用保鮮膜密封。細菌于37 ℃條件下恒溫培養20 h，霉菌于28 ℃條件下恒溫培養4～5 d。培養結束，用十字交叉法測量各抑菌圈直徑，結果取平均值。每個菌種重復試驗9次[16]。

(2) 最低抑菌濃度(MIC)的測定：采用平板法[17]。氣相抑菌試驗中精油的濃度表示為培養皿內單位體積空氣中的精油質量，即mg/L(空氣)[18]。無菌條件下，向每個培養皿加入15 mL冷卻至45 ℃左右的培養基，待培養基自然冷卻凝固后滴入菌懸液100 μL，涂布均勻，待菌液被吸收后倒置放置。用移液槍吸取一定體積的桉葉精油至含菌平板的皿蓋內中央，使細菌培養皿內空氣中桉葉精油濃度分別達到0.180 0 ，0.090 00，0.045 00，0.022 50，0.011 25 mg/mL(空氣)，霉菌分別為0.720，0.360，0.180，0.090，0.045 mg/mL(空氣)(9 cm培養皿去除培養基后的空間體積約為100 mL)，以不添加桉葉精油的培養皿為空白對照。培養皿用保鮮膜密封，培養時間和溫度同上。以不生長菌的樣品的最低濃度為精油對該菌的氣相MIC。每個菌種重復試驗9次。

1.2.4 精油液相擴散抑菌試驗

(1) 抑菌圈的測定：采用平板打孔法[19]。無菌條件下，直徑為9 mm的無菌槍頭在含菌平板中央打1個孔，無菌鑷子剔去孔內培養基，用無菌移液槍吸取1滴上述45 ℃左右的培養基封底。向孔內滴加桉葉精油，桉葉精油添加量依次為5，10，25 μL，以添加無菌水為空白對照，培養皿用保鮮膜密封。培養溫度和時間同1.2.3，測量抑菌圈大小。

(2) MIC的測定：取無菌試管9支，編號。第1～6號管采用試管二倍稀釋法[20]，依次配成含桉葉精油濃度為36.00，18.00，9.00，4.50，2.25，1.13 mg/mL液體培養基的系列濃度。無菌環境下向1～6號管中分別添加100 μL菌懸液，第7號管添加液體培養基和菌懸液，為陽性對照，第8號管僅添加液體培養基，第9號管僅添加精油。試管用硅膠塞塞緊，置于搖床培養箱中培養，轉速180 r/min，溫度和時間同1.2.3。以肉眼可見澄清透明的試管中精油的最低濃度為對應菌種的MIC。

1.2.5 精油固相擴散抑菌試驗

(1) 抑菌圈的測定：無菌條件下，取1片直徑6 mm的濾紙片貼于含菌平板瓊脂表面中央，并使之展開，向濾紙片上滴加桉葉精油，滴加在濾紙片上的精油量依次為5，10，25 μL。以添加無菌水的濾紙片為空白對照，培養皿用保鮮膜密封。培養溫度和時間同1.2.3，測量抑菌圈大小[18]。

(2) MIC的測定：采用平板稀釋法[21]。桉葉精油以丙二醇為稀釋劑，用二倍稀釋法配置成不同濃度的溶液。準確量取20 mL冷卻至45 ℃左右的培養基，加至含1 mL桉葉精油溶液的無菌平皿中，搖勻。待培養基凝固后滴入菌懸液100 μL，涂布均勻。精油濃度為36.00，18.00，9.00，4.50，2.25，1.13 mg/mL 培養基。培養時間和溫度同1.2.3。以不生長菌的培養皿所對應的最低濃度為精油對該菌的固相MIC。

1.2.6 桉葉精油成分分析 采用氣相色譜—質譜(GC-MS)聯用技術[17]。

1.2.7 氣相桉葉精油成分分析

(1) 樣品前處理：取樣品1 g，置于50 mL固相微萃取儀頂空采樣瓶中，插入PDMS-100 μL纖維頭在常溫下萃取桉葉精油揮發物，快速抽出萃取頭并立即插入氣象色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析4 min后進樣[22]。

(2) 氣相色譜和質譜條件：參照文獻[17]。

2 結果與分析

2.1 抑菌效力測定結果

通過測定桉葉精油對供試菌抑菌圈的大小初步確定桉葉精油氣相擴散的抑菌效力，結果見表1。抑菌圈試驗的判定標準：>20 mm：極度敏感，15～20 mm：高度敏感，10～15 mm：中度敏感，7～10 mm：低度敏感，無抑菌圈者為不敏感[23-24]。

表1桉葉精油對供試菌的抑菌直徑

Table 1 Inhibition zone diameters of tested microorganisms byEucalyptusessentialoil (n=9)mm

由表1可知，桉葉精油添加量為25 μL時，除對黑曲霉的固相抑菌圈直徑為18.17 mm(高度敏感)外，各抑菌方式下的抑菌圈直徑均低于20 mm(極度敏感范圍)。在10 μL時，液相擴散抑菌圈直徑比氣相和固相略大，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在18～22 mm范圍內，而對黑曲霉菌的抑菌圈直徑為8～12 mm。在5 μL時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現為中高度敏感，黑曲霉表現為中低度敏感。

總體來看，桉葉精油在氣相、液相和固相擴散抑菌方式下對供試菌均具有明顯抑菌效力，且與劑量正相關，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用均優于黑曲霉，與岳淑麗等[17]的研究結果一致。氣相擴散時桉葉精油的抑菌效力略低于液相，與固相擴散抑菌效力未有太大差異。固相擴散抑菌圈小是因為添加在濾紙片上的桉葉精油易揮發，作用濃度小，使抑菌效力減弱[25]。氣相擴散抑菌圈小，一方面因為桉葉精油擴散到培養皿空間中，無法形成高濃度的抑菌點，另一方面桉葉精油中某些抑菌成分揮發性較弱或不揮發，氣相桉葉精油中這部分抑菌成分含量較低，從而無法發揮抑菌作用[25]。

2.2 MIC值測定結果

在3種抑菌方式下測定桉葉精油對供試菌的MIC值，結果見表2。

表2的結果進一步證實了在3種抑菌方式下，桉葉精油對黑曲霉的抑制效果略差。桉葉精油氣相擴散對供試菌的MIC值(0.045～0.36 mg/mL)顯著低于液相的(4.5～18 mg/mL)和固相的(4.5～18 mg/mL)，說明氣相擴散時桉葉精油抑菌效果更好。桉葉精油不直接添加到培養基中，其揮發成分對供試菌仍具有較強的抑菌活性，這是因為精油揮發成分中某些單萜物質具有較強的滲透性，更易被細胞吸收，破壞微生物生長，因此較低劑量的桉葉精油即可抑制常見腐敗菌[19]，說明微膠囊形式可應用到氣調保鮮中。

表2 桉葉精油對供試菌的最低抑菌濃度

2.3 桉葉精油成分分析結果

采用氣質聯用法測桉葉精油成分，其總離子流譜圖見圖1。采用頂空固相微萃取-氣質聯用法測定按葉精油揮發性成分，其總離子流譜圖見圖2。

圖1 桉葉精油的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of chemical components of Eucalyptus essential oil

圖2 氣相桉葉精油的總離子流圖

Figure 2 Total ion chromatogram of chemical components of vapor-phaseEucalyptusessentialoil

圖2中，由于桉葉精油揮發性成分中多種物質的離子出峰時間很接近，使得離子流圖看起來出現了連峰。

利用計算機對圖1和圖2分離出的各組分提取質譜圖，用NIST14標準譜庫進行檢索，根據質譜裂解規律進行核對，參考標準圖譜和相關文獻[17,26-28]確定各組分的化學結構，用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，結果見表3。

由表3可知，桉葉精油共檢測出66種物質，鑒定出其中的36個化合物，占精油總量的96.576%。含量超過1%的化學成分共有12種，按含量高低分別為α-蒎烯、1,4-桉葉素、右旋檸檬烯、o-傘花烴、莰烯、異松油烯、1,8-桉葉素、3-蒈烯、γ-松油烯、α-水芹烯、月桂烯、3-對薄荷烯。桉葉精油中，萜烯類化合物14種，占58.707%；烷烴類化合物7種，占1.893%；醇類化合物13種，占25.807%；苯類化合物1種，占9.516%；酮類化合物1種，占0.148%；醚類化合物1種，占0.504%。

氣相桉葉精油共檢測出32種物質，鑒定出其中的27個化合物，占氣相成分總量的99.492%。含量超過1%的化學成分共有11種，按含量高低分別為α-蒎烯、右旋檸檬烯、波斯菊萜、右旋莰烯、1,4-桉葉素、3-蒈烯、異松油烯、(-)-反式蒈烷、月桂烯、蒈烷。氣相桉葉精油中，萜烯類化合物14種，占82.042%；烷烴類5種，占5.448%；醇類化合物8種，占11.961%；苯類化合物1種，占0.041%。

表3 桉葉精油及氣相桉葉精油的化學成分及相對含量

由表3可知，物態的變化并未對桉葉精油的主要成分造成明顯影響，桉葉精油與氣相桉葉精油均以萜烯類和醇類物質為主[28-29]。氣相桉葉精油中萜烯類化合物的相對含量升高了23.335%，烷烴類化合物的相對含量升高了3.555%，醇類化合物的相對含量減少了13.846%，苯類化合物的相對含量減少了9.475%，未檢出酮類和醚類化合物， 結合2.1的抑菌圈試驗結果可知這部分減少或消失的物質是氣相抑菌效力稍差的原因[30-31]。據報道，小分子的萜烯類物質、酚類物質和醛酮類物質是精油的主要抑菌有效成分，醇類、醚類、苯類物質也具有一定的抑菌活性[32-34]。本試驗測得的桉葉精油及氣相桉葉精油中均含有萜烯類、醇類、苯類等物質，因此桉葉精油及氣相桉葉精油均具有一定的抑菌活性。

結合2.2的結果可知，桉葉精油的抑菌活性與成分及其含量有關[20,28]。氣相桉葉精油中減少的醇類物質主要為1,8-桉葉素和1,4-桉葉素，而抑菌活性卻有所提高，與Tyagi A K等[19]的研究結果一致，可見萜烯類化合物的成分及其含量是影響桉葉精油抑菌活性的主要因素[17,20]。據報道[30,35-38]，α-蒎烯、莰烯、右旋檸檬烯、1,8-桉葉素、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等物質具有一定程度的抑菌活性，說明氣相桉葉精油的抑菌活性與α-蒎烯、右旋檸檬烯、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等單萜物質有關。

3 結論

本試驗的結果表明氣相桉葉精油具有明顯抑菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制作用較好，對黑曲霉抑制作用稍差。氣相桉葉精油中減少或消失的醇類、苯類、酮類和醚類等不揮發或揮發性稍差的物質，是導致抑菌效力稍差的主要原因[10]。氣相桉葉精油對供試菌的MIC值(0.045～0.36 mg/mL)顯著低于液相的(4.5～18.0 mg/mL)和固相的(4.5～18.0 mg/mL)，說明桉葉精油不直接添加到培養基中，其揮發成分對供試菌也有較強的抑制作用。桉葉精油物態的變化并未對其主要成分造成明顯的影響，氣相桉葉精油仍以萜烯類和醇類物質為主。氣相桉葉精油的抑菌活性與α-蒎烯、右旋檸檬烯、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等單萜物質有關，萜烯類物質相對含量的升高導致抑菌活性變強，單萜物質在氣相狀態下更易被細胞吸收，從而更有效地發揮抑菌作用[15]，說明桉葉精油的抑菌活性還與抑菌成分的物態形式有關，具體作用機制有待更深入的研究?？傊?，氣相桉葉精油可以在空間中發揮抑菌作用，這為桉葉精油微膠囊應用到氣調保鮮中提供了理論依據。

[1] GOLDBECK J C, NASCIMENTO J E, JACOB R C, et al. Bioactivity of essential oils from Eucalyptus globulus and Eucalyptus urograndis against planktonic cells and biofilms of Streptococcus mutans[J]. Industrial Crops and Products, 2014, 60: 304-309.

[2] 黃承標, 楊鈣仁, 魏國余, 等. 按樹林地枯枝落葉層的水文特性及養分貯量[J]. 福建林學院學報, 2011, 31(4): 289-294.

[3] 陳默, 余永莉. 桉葉油的化學成分及其生物活性研究進展[J]. 中國現代醫藥雜志, 2014(4): 97-100.

[4] ANNE K T, AYYAZ M. Antimicrobial potential and chemical composition of Eucalyptus globules oil in liquid and vapour phase against food spoilage microorganisms[J]. Food Control, 2011, 22(22): 1 707-1 714.

[5] GOLDBECK J C, NASCIMENTO J E, JACOB R G, et al. Bioactivity of essential oils from Eucalyptus globulus and Eucalyptus urograndis against planktonic cells and biofilms of Streptococcus mutans Malik A[J]. Ind. Crop. Prod.， 2014, 60: 304-309.

[6] 王揮, 龔吉軍, 唐靜, 等. 肉桂與桉葉復合精油處理對“夏黑”葡萄保鮮質量的影響[J]. 食品安全質量檢測學報, 2016, 7(9): 3 703-3 709.

[7] BATISH D R, SINGH H P, KOHLI R K. Eucalyptus essential oil as a natural pesticide[J]. Forest Ecol. Manag., 2008, 256(12): 2 166-2 174.

[8] 周春禾, 王建清, 金政偉. 尤加利精油制備微膠囊抗菌纖維素薄膜[J]. 包裝工程, 2011, 32(1): 40-42.

[9] 任小玲, 岳淑麗, 向紅, 等. 桉葉精油微膠囊工藝優化及緩釋性能研究[J]. 包裝工程, 2017, 38(9): 107-112.

[10] GILLESM, ZHAO J, AN M, et al. Chemical composition and antimicrobial properties of essential oils of three Australian Eucalyptus species[J]. Food Chemistry, 2010, 119(2): 731-737.

[11] OLOLADE Z S, OLAWORE N O, OLASOJI S O, et al. Chemical composition and bactericidal activities of the leaf essential oil of eucalyptus maculata hook[J]. Natural Product Chemistry Research, 2017, 5(2): 257-260.

[12] 周漢軍. 桉葉精油提取、納米乳化及其抑菌活性研究[D]. 長沙: 中南林業科技大學, 2016: 3-4, 21-23.

[13] 劉偉. 藍桉葉精油微波無溶劑法提取及抗氧化、抗菌活性研究[D]. 哈爾濱: 東北林業大學, 2015: 25-28.

[14] 童迅, 高雯, 黃庭軒, 等. 濃縮果汁中耐熱霉菌的分析及鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(20): 198-202.

[15] 劉曉麗, 鐘少樞, 吳克剛, 等. 丁香和肉桂精油氣相抑菌活性研究[J]. 食品與發酵工業, 2010, 36(1): 21-24, 38.

[17] 岳淑麗, 任小玲, 陳霞, 等. 桉葉精油包埋前后抑菌性能及成分比較研究[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 155-160.

[18] 劉曉麗, 吳克剛, 柴向華, 等. 肉桂精油對儲糧霉菌的抑制作用研究[J]. 安徽農業科學, 2012, 40(27): 13 570-13 572.

[19] TYAGI A K, MALIK A. Antimicrobial potential and chemical composition of Eucalyptus globulus oil in liquid and vapour phrase against food spoilage microorganisms[J]. Food Chem., 2011, 126: 228-235.

[20] 藍亮美, 馬麗, 郭占京, 等. 三種桂產桉葉油對常見致腐菌的抑制作用研究[J]. 食品工業科技, 2014, 35(22): 155-158.

[21] 郭俊賢, 劉曉麗, 吳克剛, 等. 11種精油對三種水產品特定腐敗菌的抑制[J]. 中國食品添加劑, 2014(6): 54-57.

[22] 楊忠全, 闞建全, 陳光靜, 等. 新鮮薏仁米與異味薏仁米揮發性成分對比分析[J]. 食品與機械, 2017, 33(7): 35-39.

[23] ROTA M C, HERRERA A, MARTINEZ R M, et al. Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgar is, Thymuszyg-is and Thymus hyemal is essential oils[J]. Food Control, 2008, 19(7): 681-687.

[24] 劉光發, 王建清, 趙亞珠. 牛至精油微膠囊的制備及其抑菌效果研究[J]. 包裝工程, 2012, 33(3): 19-22.

[26] 田玉紅, 周琪, 頗俊華, 等. 廣林九號桉葉精油的抑菌活性研究[J]. 湖北農業科學, 2013(21): 5 193-5 196.

[27] KUMAR P, MISHRA S, MALIK A, et al. Compositional analysis and insecticidal activity of Eucalyptus globules (family: Myrtaceae) essential oil against housefly (Musca domestica)[J]. Acta. Trop., 2012, 122(2): 212-218.

[28] 葉舟. 大葉桉葉精油化學成分及其抑菌活性[J]. 福建林學院學報, 2007, 27(1): 48-51.

[29] AIT-OUAZZOU A, LORN S, BAKKALI M, et al. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of Thymus algeriensis, Eucalyptus globulus and Rosmarinus officinalis from Morocco[J]. J. Sci. Food Agric., 2011, 91(14): 2 643-2 651.

[30] BAKKALI F, AVERBECK S, AVERBECK D, et al. Biological effects of essential oils: a review[J]. Food Chem. Toxicol., 2008, 46(2): 446-475.

[31] SPEROTTO A R M, MOURA D J, PéRES V F, et al. Cytotoxic mechanism ofPipergaudichaudianumKunth essential oil and its major compound nerolidol[J]. Food Chem. Toxicol., 2013, 57(12): 57-68.

[32] TYAGI A K, MALIK A. Antimicrobial potential and chemical composition of Mentha piperita oil in liquid and vapour phase against food spoiling microorganisms[J]. Food Control, 2011, 22 (11): 1 707-1 714.

[33] TYAGI A K, MALIK A. In situ SEM, TEM and AEM studies of the antimicrobial activity of lemon grass oil in liquid and vapour phase against Candida albicans[J]. Micron., 2010, 41(7): 797-805.

[34] LEOPOLO J, GERHARD B, ALBERA S, et al. Composition quality control and antimicrobial activity of the essential oil of long time dill seeds from Bulgaria[J]. Chem. Nat. Compd., 2003, 51(2): 3 854-3 857.

[35] 夏忠弟, 毛學政, 羅映輝.α-蒎烯抗真菌機制的研究[J]. 湖南醫科大學學報, 1999(6): 507-509.

[36] 郝靜梅, 盛冉, 孫志高, 等. 檸檬烯抗菌性研究進展[J]. 食品與發酵工業, 2017, 43(2): 274-278.

[37] 關天旺, 劉嘉煜. 檸檬烯的防腐作用及抑菌機理研究進展[J]. 保鮮與加工, 2015(6): 83-87.

[38] 何麗芝, 王婧, 趙振東, 等. 3-蒈烯資源及其生物活性應用研究進展[J]. 林產化學與工業, 2011, 31(3): 122-126.