槐角多糖表征及抗氧化吸濕保濕性能研究

李彩霞 - 鄭 雪 高海寧 - 張 勇

(1. 河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000； 2. 甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

槐角又稱槐實，為豆科植物國槐(SophorajaponicaL.)的果實，是一味常用中藥[1]。陳明珠等[2]對槐角化學成分進行了研究，發現其含有黃酮、異黃酮、三萜皂苷、氨基酸、生物堿、磷脂和多糖等多種藥理活性成分。目前國內外學者對槐角多糖研究已有報道，劉景東等[3]研究發現，槐角含有豐富的多糖；Ertan A等[4]對槐豆膠與卡拉膠的熱相變協同作用進行了研究，發現槐豆膠與其他親水膠體相互作用產生凝膠；卞云霞等[5]研究了槐豆多糖及其配合物的抑菌活性，結果顯示不同的配合物對供試菌抑菌效果有差異，以上研究側重于多糖與凝膠復配方面的報道，而未見多糖的抗氧化及保濕方面的研究。國槐資源豐富，其多糖含量高，因此有一定的研究價值。

天然多糖廣泛存在于自然界中，是構成生命的四大基本物質之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗輻射，調節人體免疫力等作用[6-8]，同時又具有強吸水性、乳化性、高黏度性和成膜性[9]，因此可以作為功能性添加劑，在醫藥、食品等領域中有廣泛應用前景。

本試驗以槐角果皮和種子為材料，采用雙酶法從槐角果皮和種子中提取多糖，通過紅外光譜對結構進行表征，并考察多糖對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除作用及對亞鐵離子的螯合能力，綜合評價多糖的體外自由基清除活性，同時探討多糖的吸濕和保濕性能，以期為槐角多糖在天然抗氧化劑和化妝品等領域的開發利用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

槐角：采自河西學院，剝離果皮和種子，分別洗凈、陰干、粉碎、過篩(60目)，保存備用；

2,2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯林-6-磺酸(ABTS)、菲洛嗪(Ferrozine)、二苯代苦味肼基 (DPPH)：純度≥99%，美國Sigma公司；

L-甲硫氨酸：分析純，北京拜爾迪生物公司；

氯化硝基四氮唑藍(NBT)：分析純，南京奧多福尼生物科技有限公司；

葡聚糖：純度≥99%，國藥集團化學試劑有限公司；

果膠酶：3.2 U/g，北京雙旋微生物培養基制造廠；

纖維素酶：≥1 000 U/mg，北京奧博星生物技術有限公司；

正丁醇、氯仿等試劑：分析純，上海中秦化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：AE200型，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；

可見分光光度計：S-24型，上海棱光技術有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-2000型，河南省鞏義市英峪予華儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國華電器有限公司；

高速冷凍離心機：CR21GII型，日本日立公司；

冷凍干燥機：MiLLROCK型，美國米爾洛克公司；

旋轉蒸發器：RE-2000A型，鞏義市京華儀器有限責任公司；

酸度計：pH510型，安萊立斯儀器科技(上海)有限公司；

紅外光譜儀：Nicolet iS50型，美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 槐角果皮和種子多糖的提取及含量測定

(1) 提取工藝流程：

原料→粉碎→石油醚脫脂→干燥→雙酶法提取[以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶劑，料液比1∶20 (g/mL)，混合酶(纖維素酶∶果膠酶質量比1∶1)添加量0.5%，底物濃度5%，初始pH 4.8，酶解溫度50 ℃，酶解時間1 h]→高溫滅酶(80～90 ℃，10 min)→冷卻至室溫→離心(5 000 r/min，10 min)→上清液→減壓濃縮(至原液體積的 1/10)→醇沉(濃縮液中加入3倍體積95%乙醇，靜置過夜)→離心(5 000 r/min，5 min)→沉淀按1∶5 (g/mL)加入蒸餾水→加入 1/4 體積的Sevage試劑脫蛋白(3次)→醇沉(加入3倍體積95%乙醇，靜置過夜)→離心(5 000 r/min，10 min)→沉淀冷凍干燥(-40～-47 ℃，壓力17.42 Pa)→槐角果皮/種子多糖

(2) 多糖含量測定：根據文獻[10]修改如下，準確稱取105 ℃干燥至恒重的葡聚糖100 mg，溶解后定容于100 mL容量瓶中，并稀釋成100 μg/mL葡聚糖標準溶液。精密吸取葡聚糖標準溶液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL用蒸餾水補充至2.00 mL，加入1 mL 6%苯酚，搖勻，然后加入5 mL 濃H2SO4，置于室溫下反應20 min，冷卻后于490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，并求得Y=0.005 8X+0.000 1(R2=0.999 2)的線性回歸方程。

根據1.3.1方法提取多糖，稀釋一定倍數后，精密吸取1 mL，按標準曲線制作方法操作，在490 nm處測定吸光度，按式(1)計算多糖的得率：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

C——標準曲線上查得的多糖含量，μg；

V——多糖提取液總體積，mL；

N——樣品的稀釋倍數；

M——樣品的重量，g；

VS——測定時所取溶液的毫升數，mL。

根據上述方法測定果皮和種子多糖粗提物中多糖含量，并計算其純度。

1.3.2 紅外光譜(IR)表征 取2 mg 左右干燥多糖，加入適量KBr 粉末研磨混勻后，壓片，在波數4 000～400 cm-1內掃描果皮和種子多糖的紅外光譜圖。

1.3.3 多糖的抗氧化性測定

(1) 對ABTS自由基的清除作用測定：根據文獻[11]修改如下，將2.00 mL稀釋成一定質量濃度(種子：92.80～464.02 μg/mL；果皮：197.63～988.16 μg/mL)的多糖溶液和2.00 mL的ABTS混合為反應體系，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL 的ABTS混合液為對照組，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL 多糖溶液的混合液為空白組，將各組在暗處靜置6 min，在734 nm處測定吸光度。以不同質量濃度的VC作陽性對照。按式(2)計算ABTS自由基的清除率。

(2)

式中：

R——清除率，%；

A0——對照組吸光值；

Ai——多糖溶液吸光值；

Aj——空白組吸光值。

(2) 對DPPH自由基的清除能力：根據文獻[12]修改如下：將2.00 mL稀釋一定質量濃度的槐角果皮(或種子)多糖溶液和2.00 mL的DPPH溶液(0.15 mmol/L的95%乙醇溶液)為測定組，2.00 mL蒸餾水和2.00 mL DPPH溶液為對照組，2.00 mL多糖溶液和2.00 mL 95%乙醇為樣品空白組，搖勻，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm波長下測定吸光度，以VC作陽性對照，DPPH自由基清除率按式(3)計算：

(3)

式中：

R——清除率，%；

A0——未加多糖溶液對照組吸光值；

Ai——加多糖溶液吸光值；

Aj——以95%乙醇代替DPPH溶液時的吸光值。

(3) 對超氧陰離子自由基的清除能力測定：參照文獻[13]，根據式(4)計算超氧陰離子自由基的清除率。

(4)

式中：

R——清除率，%；

A0——蒸餾水代替多糖的吸光值；

Ai——加入多糖溶液吸光值；

Aj——多糖溶液的本底吸光值。

(4) 對亞鐵離子的螯合能力測定：根據文獻[6]，金屬螯合率按式(5)計算：

(5)

式中：

R——螯合率，%；

A0——蒸餾水代替多糖溶液吸光值；

Ai——加多糖溶液的吸光值；

Aj——多糖溶液的本底吸光值。

1.3.4 吸濕保濕性能測定

(1) 槐角果皮和種子多糖的吸濕性：根據文獻[6]修改如下，將200 mL的硫酸銨飽和溶液置于干燥器底部，使干燥器內的相對濕度為81%。準確稱取充分干燥后的果皮多糖、種子多糖、甘油、殼聚糖各0.5 g于稱量瓶，置于濕度和溫度相對恒定的干燥器中并密封。放置3，15，19，28，39，45，50，67，76，90 h后，分別稱量樣品放置前后的質量，根據式(6)計算多糖的吸濕率。

(6)

式中：

A——吸濕率，%；

Wo——樣品放置前質量，g；

Wn——樣品吸水后質量，g。

(2) 槐角果皮和種子多糖的保濕性：根據文獻[14]修改如下：在干燥器底部放入200 g 烘干的變色硅膠，準確稱取充分干燥后的果皮多糖、種子多糖、甘油、殼聚糖各1 g置于內徑30 mm恒重的稱量瓶中，分別加入1 mL蒸餾水，充分搖勻，放入干燥器中并密封。放置6，15，21，27，39，50，70 h，分別稱量樣品放置不同時間的水分質量(Hn)和添加水分質量(Ho)，根據式(7)計算多糖的保濕率。

(7)

式中：

R——保濕率，%；

Ho——添加的水分質量，g；

Hn——放置不同時間的水分質量，g。

1.4 統計方法

所有的試驗均3次重復，試驗數據采用Excel 2003軟件進行統計分析、Origin 9軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 槐角果皮和種子中多糖含量的比較

通過雙酶法提取槐角果皮和種子多糖，采用苯酚硫酸法測定槐角果皮和種子中多糖的得率分別為24.7%，11.6%，該數據表明槐角種子和果皮中含有豐富的多糖，且果皮中多糖含量高于種子。并測定了果皮和種子多糖粗提物中多糖的含量，分別為72.39%，76.95%，從結果來看，種子多糖的純度高于果皮多糖的。

2.2 紅外光譜(IR)分析

由圖1可知，槐角兩部位多糖均有多糖的特征吸收峰，3 420 cm-1和3 300 cm-1處是多糖中O—H的伸縮振動引起的吸收峰，2 970 cm-1是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動所形成的吸收峰[15]，1 610 cm-1是—OH 的彎曲振動的吸收峰，1 410 cm-1和1 300 cm-1處是C—O 的變形振動的吸收峰[16]，1 140 cm-1左右和1 080 cm-1左右為吡喃型甘露糖和半乳糖上伯、仲羥基的C—O的振動吸收峰[17]，893 cm-1是吡喃糖C—H變角振動的吸收峰，果皮多糖在893 cm-1和839 cm-1均有吸收，說明該糖是β-型和α-型2種糖苷鍵吡喃糖對稱振動所產生的吸收峰[18]。

圖1 槐角果皮和種子多糖紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectrogram of polysaccharides of pericarp and seed from Sophora japonica L.

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 槐角果皮和種子多糖對ABTS自由基的清除能力

ABTS是一種水溶性的自由基，經氧化后生成藍綠色的陽離子ABTS自由基，向其中加入樣品，如果該樣品含有抗氧化物質，能夠提供供氫體，則會褪色。在734 nm下吸光度降低，其降低程度與抗氧化物質的抗氧化活性有關，通過光吸收的下降程度可反映該物質抗氧化活性的強弱[11,19]。由圖2、3可知，槐角果皮、種子多糖和VC溶液均對ABTS自由基有一定的清除能力，其清除率均隨濃度增大而增大。果皮多糖、種子多糖和VC在質量濃度分別為247.04，232.01，12.50 μg/mL 時對ABTS自由基的清除率分別為40.05%，71.83%，86.92%，表明多糖對ABTS自由基有很好的清除能力但弱于VC。

2.3.2 槐角果皮和種子多糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在517 nm處有最大吸收，當反應體系中含有抗氧化物時，抗氧化物提供一個電子與其配對結合，使DPPH自由基的特征紫色消失，其吸收值降低，樣品的抗氧化活性根據DPPH自由基的清除量來評價[20]。由圖4、5可知，不同部位的多糖對DPPH自由基的清除能力不同，槐角果皮和種子多糖的質量濃度分別為494.08，464.02 μg/mL時，清除率分別為15.69%，54.71%，說明種子多糖對DPPH自由基的清除效果優于果皮多糖的。VC在25 μg/mL時清除率為86.24%，表明2種多糖的清除效果不及VC。

圖2 槐角果皮、種子多糖對ABTS自由基的清除作用

Figure 2 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on ABTS radical

圖3 VC對ABTS自由基的清除作用Figure 3 Scavenging activity of VC on ABTS radical

圖4 槐角果皮、種子多糖對DPPH自由基的清除作用

Figure 4 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on DPPH radical

圖5 VC對DPPH自由基的清除作用Figure 5 Scavenging activity of VC on DPPH radical

2.3.3 槐角果皮和種子多糖對超氧陰離子自由基的清除作用 由圖6、7可知，隨著多糖和VC質量濃度的增加，對超氧陰離子自由基的清除率均在增高，在測定范圍內呈量效關系。在清除率為35%時，槐角果皮和種子多糖的質量濃度分別為494.08，154.67 μg/mL，而VC溶液在200 μg/mL時清除率為29.76%，說明對超氧陰離子自由基的清除能力種子多糖最優，VC次之，果皮多糖相對最弱。

2.3.4 槐角果皮和種子多糖對亞鐵離子的螯合能力 螯合某些金屬離子是抗氧化活性的一個重要機制，后者催化氫過氧化物的降解以及Fenton類反應，從而抑制了氧化損傷，在天然產物抗氧化活性評價中亞鐵離子螯合能力的測定有著非常重要的意義[21]。由圖8、9可知，隨著果皮和種子多糖及EDTA質量濃度的增大，對亞鐵離子的螯合率逐漸增大。當螯合率為31%時，槐角果皮、種子多糖的質量濃度分別為329.39，154.67 μg/mL，而當濃度為200 μg/mL時，EDTA螯合率達98.73%，對亞鐵離子的螯合能力的大小順序為EDTA>種子多糖>果皮多糖。

圖6 槐角果皮、種子多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

Figure 6 Scavenging activity of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on superoxide anion radical

圖7 VC對超氧陰離子自由基的清除作用Figure 7 Scavenging activity of VC on superoxide anion radical

圖8 槐角果皮、種子多糖對亞鐵離子的螯合能力

Figure 8 Chelating ability of polysaccharides of sophora fructus peel, seeds on ferrous ion

圖9 EDTA對亞鐵離子的螯合能力Figure 9 Chelating ability of EDTA on ferrous ion chelating ability

2.4 吸濕保濕能力

2.4.1 槐角果皮和種子多糖的吸濕性 由圖10可知，在相對濕度為81%的環境中，隨著吸濕時間的延長，2種多糖、殼聚糖、甘油的吸濕率逐漸增大。在最初20 h內，多糖的吸濕率增加幅度較大，隨后槐角果皮、種子多糖及殼聚糖逐漸達到飽和狀態，三者吸濕性能基本一致。在90 h時槐角果皮多糖、種子多糖，殼聚糖、甘油的吸濕率分別為12.31%，12.99%，12.38%，56.09%，說明多糖有一定的吸濕性，但弱于甘油。

圖10 吸濕率隨時間變化的曲線Figure 10 Changes of moisture absorption rate for each sample with time changing

2.4.2 槐角果皮和種子多糖的保濕性 置于干燥器底部的變色硅膠吸附環境中的水分，使其自身顏色由藍變紅，根據多糖水分降低的程度，確定其保濕性。由圖11可知，在硅膠環境中，各試樣的保濕率呈下降趨勢，在27 h時降幅均稍有減小，在70 h的監測范圍內，槐角果皮多糖、種子多糖、殼聚糖、甘油的保濕性分別為31.73%，31.27%，14.83%，58.44%。說明槐角果皮和種子多糖保濕性能差異不大，二者保濕率低于甘油，而高于保濕劑殼聚糖，均表現出良好的保濕性能。

3 結論

本試驗以槐角果皮和種子作為研究對象，采用雙酶法提取多糖，測得槐角果皮中多糖(24.7%)的得率高于種子的(11.6%)，通過酶法提取的槐角多糖高于文獻[22]報道的水浴加熱回流所提取的，說明酶法有利于多糖的提取。本研究結果表明，果皮和種子粗提取物中，多糖含量分別為72.39%和76.95%，說明粗多糖中含有一定的雜質，需要更進一步分離純化。對多糖進行紅外掃描，均具有多糖的特征吸收峰，種子多糖具有β-吡喃糖苷鍵，果皮多糖具有β-型和α-型2種糖苷鍵。

圖11 保濕率隨時間變化的曲線Figure 11 Changes of moisture retention rate for each sample with time changing

植物不同部位不同種類的多糖功能各不相同，生物活性也不同[23-24]。從試驗結果可以看出，種子多糖對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、亞鐵離子螯合力均高于果皮多糖，可能與糖的種類和結構有關，需要更進一步研究。多糖對自由基清除作用表明，種子多糖的清除活性優于果皮多糖，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的半數清除濃度分別為417.76，397.71 μg/mL，與文獻[25]數據對比說明種子多糖具有很好的自由基清除活性。

槐角果皮和種子多糖的吸濕保濕性能結果顯示，在相同的監測時效內，槐角果皮多糖、種子多糖和殼聚糖三者的吸濕率基本一致，且均低于甘油；保濕性能方面，在39 h時槐角果皮多糖和種子多糖及甘油的保濕率均高于50%，均低于甘油而高于殼聚糖，可見，槐角果皮多糖和種子多糖具有良好的保濕作用。綜上所述，槐角果皮和種子多糖在食品中可以作為增稠劑、保水劑，在化妝品領域可以作為抗氧化劑和保濕劑。本研究僅對粗多糖清除幾種自由基的能力和吸濕保濕性能進行了研究，后續將對其有效成分進行分離、純化，為國槐產品的開發利用提供理論依據。

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