Xpert MTB/RIF技術在早期診斷耐藥結核中的應用研究

何 坤，夏 勇，袁國丹

(重慶市公共衛生醫療救治中心 400000)

·經驗交流·

Xpert MTB/RIF技術在早期診斷耐藥結核中的應用研究

何 坤，夏 勇△，袁國丹

(重慶市公共衛生醫療救治中心 400000)

目的探討結核分枝桿菌/利福平耐藥熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert MTB/RIF)技術早期判斷耐藥結核的臨床應用價值。方法收集本中心462例確診為結核病患者的痰樣本，分別進行Xpert MTB/RIF技術檢測、結核羅氏培養+藥敏試驗檢測。結果Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥率為22.6%(95/420)，快速藥敏檢測利福平耐藥率為19.8%(83/420)，比較差異有統計學意義(P<0.05)；兩種方法檢測對利福平均耐藥者為78株，平均敏感者為320株，兩種方法結果一致率為94.8%(398/420)。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的結果敏感度93.97%，特異度94.96%。對結果進行Kappa一致性檢驗，Kappa=0.843，一致性較好，陽性預測值82.11%，陰性預測值98.46%。結論Xpert MTB/RIF檢查可快速、準確判斷對利福平耐藥的結核。

Xpert MTB/RIF；利福平；肺結核；結核羅氏培養；藥敏試驗

結核病是一種危害人類健康的傳染性疾病，我國為結核高發國家之一。據WHO監測統計，新的結核病患者中，有10.2%的患者會出現對至少一種抗結核藥物耐藥。我國每年新增耐多藥結核(MDR-TB)患者約12萬人，其傳染性更強、治愈率更低，病死率可達1/4，因此如何更好地發現結核病患者，尤其是MDR-TB患者，是控制耐藥結核傳播的關鍵[1]。在抗結核治療時了解患者否對利福平耐藥至關重要，其可作為MDR-TB判斷標準[2-3]。國外已有文獻報道了Xpert MTB/RIF技術在肺結核診斷中的準確性[4-5]。本研究收集本中心462例確診為結核病患者的痰標本進行Xpert MTB/RIF技術與結核培養、藥敏試驗檢測，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1-12月于本中心就診的初次確診為結核病且既往從未服用過任何抗結核藥物的患者462例，其中男277例，女185例，年齡15～75歲。患者均已簽訂知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑 Xpert MTB/RIF反應盒及樣品試劑(SR)均購自美國Cepheid公司；結核羅氏培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.2.2檢測方法 對所有確診結核患者的痰標本進行Xpert MTB/RIF技術檢測、結核羅氏培養+藥敏試驗檢測。按照結核病診斷實驗室檢驗流程進行操作[6]。

1.2.2.1Xpert MTB/RIF核酸擴增檢測 取1 mL痰標本放至有螺旋蓋的前處理管中，然后加入2倍痰標本體積的SR痰標本處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。打開反應盒，取2 mL處理后的樣品由加樣孔緩慢加入反應盒，然后將反應盒放置到檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果。

1.2.2.2結核羅氏培養 吸取2.0 mL痰標本至帶螺旋蓋的前處理管中，視樣本性狀，加入1～2倍體積4%氫氧化鈉前處理液，置渦旋振蕩器上振蕩30～60 s，至標本充分混勻，室溫放置15 min。前處理完成后，以無菌吸管吸取前處理液0.1 mL，均勻接種在2支中性羅氏培養基斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培養24 h 后，直立放置37 ℃ 繼續培養。接種后第3、7天觀察培養情況，此后每周觀察1 次，并在分離培養結果記錄本上記錄生長結果

1.2.2.3結核快速藥敏試驗 用接種環取1 環培養基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1 mg/mL 菌懸液，梯度稀釋為10-1mg/mL，接種0.01 mL到對硝基苯甲酸(PNB) 和噻吩-2-羧酸肼(TCH) 培養基，同時梯度稀釋10-2mg/mL 和10-4mg/mL，接種0．01 mL 到含利福平(40.0 μg/mL)和異煙肼(0.2 μg/mL)的羅氏固體培養基和空白對照管培養基，37 ℃培養4 周，觀察結果。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料用率表示，組間采用χ2檢驗、校正χ2檢驗和確切概率法，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。對Xpert MTB/RIF技術檢測和結核快速藥敏進行一致性kappa檢驗，≥0.75認為一致性較好。

2 結 果

2.1基本情況 462例確診結核的患者痰標本全部進行Xpert MTB/RIF技術檢測、結核羅氏培養+藥敏試驗。Xpert MTB/RIF技術檢測結果為陽性460例(99.6%)，陰性2例(0.4%)；結核羅氏培養檢測結果為陽性420例(90.9%)，因此本研究中以420例樣本進行分析。

2.2藥敏試驗檢測結果 以結核快速藥敏試驗結果為金標準，經Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥率22.6%(95/420)，快速藥敏檢測利福平耐藥率19.8%(83/420)，兩種方法檢測對利福平均耐藥者為78株，平均敏感者為320株，兩種方法結果一致率為94.8%(398/420)，耐藥率比較差異有統計學意義(P<0.05)。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的結果敏感度93.97%，特異度94.96%。對結果進行Kappa一致性檢驗，Kappa=0.843，數值大于0.75表明一致性較好，陽性預測值82.11%，陰性預測值98.46%。

2.3異煙肼與利福平交叉耐藥對比 以結核快速藥敏試驗結果為金標準，本研究中利福平耐藥共83株，其中同時對異煙肼耐藥有73株，利福平、異煙肼同時耐藥比例為88%。

3 討 論

結核病和結核病耐藥性的準確、快速檢測對提高患者預后和降低結核病的傳播至關重要。傳統的抗酸染色涂片被廣泛應用于結核快速診斷，但其靈敏度低，容易漏診，且無法區分非結核分枝桿菌(NTM)。結核培養及藥敏試驗作為金標準，固體培養需要4至6周，在結核培養基礎上進行藥敏檢測，需要2至4周，總計大概需要3個月，無法滿足臨床診療需求。因此，需要一種快速、簡便、準確的檢測方法用于臨床診斷及指導治療。

目前，分子生物學發展迅猛，有多種方法檢測結核耐藥性。其中有3個試驗方法檢測臨床標本中結核菌株是否耐藥，結果較為理想。Geno Type MTB DRplus(海恩基礎生物，德國)主要檢測rpoB、KatG基因是否突變，從而判斷是否對利福平、異煙肼耐藥。INNO-LIPA Rif TB試劑盒(Fujirebio，比利時)檢測靶向DNA基因rpoB突變情況。Xpert MTB/RIF(Cepheid 美國)檢測技術，整合傳統PCR檢測的3個步驟，自動化將標本提供到試劑盒，進行核酸的提取、擴增、目標序列檢測。采用半巢式實時熒光定量PCR技術，主要是檢測結核分枝桿菌及利福平耐藥基因rpoB的81 bp是否突變，明確是否耐藥[7-8]。其中，Xpert MTB/RIF檢測技術在所有分子生物檢測手段中是最具成本效益的[9-10]。WHO建議Xpert MTB/RIF技術作為結核病初期診斷測試，特別適用于懷疑合并感染HIV的患者[11-12]，避免延誤病情。

在本研究中，結核快速藥敏檢測方法作為金標準，Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥性與結核快速藥敏法具有較高一致性。Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥敏感度93.97%，特異度94.96%。對結果進行Kappa一致性檢驗，Kappa=0.843。同時，對利福平及異煙肼交叉耐藥情況進行數據對比分析，研究結果顯示兩種藥物同時耐藥率達89.00%。本研究中結果與國內外報道結果基本一致[13-14]。

因此，Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的結果具有較好可靠性，可以早期準確判斷出是否為耐多藥結核菌株。此外，在本研究中，有23例Xpert MTB/RIF技術檢測結果與結核快速藥敏不一致。原因考慮：(1)結核分枝桿菌基因表型與體外表型結果不一致，已有文獻進行報道。(2)利福平rpob基因511、533位點突變，影響檢測結果。(3)混合有非結核分枝桿菌感染[15]。在今后臨床工作中，可隨訪患者治療方案及預后，整理實驗室結果與臨床治療效果對比分析。

綜上所述，Xpert MTB/RIF技術操作簡單、快捷方便，可提供準確的診斷結果，尤其適用于對可疑耐藥結核、合并HIV感染的患者。同時，可以讓MDR-TB治療快速啟動，以待常規結核培養和藥敏結果。

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1671-8348(2017)26-3707-02

2017-02-26

2017-06-14)

何坤(1984-)，主治醫師，碩士，主要從事結核方面研究。△

，E-mail:xiayong_7777@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.039