ERα、ERβ和EGFR在人肺癌組織芯片中的表達和意義

陳素琴，袁海洪

(武清區人民醫院病理科，天津 301700)

ERα、ERβ和EGFR在人肺癌組織芯片中的表達和意義

陳素琴，袁海洪

(武清區人民醫院病理科，天津 301700)

目的 探討雌激素受體α(ERα)和β(ERβ)及表皮生長因子受體(EGFR)在肺癌患者腫瘤組織中的表達及意義。方法選取癌前病變組(不典型腺瘤樣增生)12例，原發肺癌組77例，淋巴結轉移性肺癌組12例構建成進展組織芯片。應用免疫組化方法檢測ERα、ERβ和EGFR在此芯片中的表達，并探討其相互關系。結果在進展組織芯片癌前病變組、原發肺癌組及淋巴結轉移性肺癌組中ERα的表達陽性率分別為91.67%、62.34%和25.00%，不同組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)；ERβ的表達陽性率分別為91.67%、55.84%和16.67%，不同組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)；EGFR的表達陽性率分別為25.00%、59.74%和91.67%，不同組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。在原發肺癌中，ERα表達與性別、組織學分型、腫瘤分化程度及P-TNM分期有關(P＜0.05)，ERβ表達與性別、組織學分型、腫瘤分化程度、P-TNM分期及淋巴結轉移有關(P＜0.05)，EGFR表達與淋巴結轉移及腫瘤的P-TNM分期有關(P＜0.05)。ERβ和EGFR的表達呈正相關(r=0.612，P＜0.01)。結論ERα、ERβ及EGFR均與肺癌的發生發展有關，且ERβ和EGFR的表達相關，這種潛在的機制及關聯性為將來的進一步研究提供了基礎。

組織芯片；免疫組織化學；肺癌；雌激素受體α；雌激素受體β；表皮生長因子受體

雌激素在多種腫瘤中的促癌作用已經得到證實。雌激素受體(ER)的表達與肺癌的發生發展密切相關。表皮生長因子受體(EGFR)屬于酪氨酸激酶家族，在多種癌癥中有過表達，包括肺癌[1]。相對于男性而言，女性肺癌對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療的反應更好一些[2]，這表明EGFR和ER之間可能存在某種關聯。本研究目的在于探討雌激素受體ERα、ERβ及EGFR在我國肺癌進展組織芯片中的表達情況及其與肺癌的臨床特點的關系，以及三者在肺癌中表達的相互關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取肺癌手術切除標本，癌前病變(不典型腺瘤樣增生)12例，原發肺癌77例，淋巴結轉移性肺癌12例。此77例原發肺癌標本臨床資料完整，其中腺癌35例，鱗癌33例，大細胞癌9例(按2004年WHO肺癌組織學分類標準)；男性58例，女性19例；年齡45～75歲，中位年齡6l歲；周圍型51例，中央型26例；有淋巴結轉移者36例，無淋巴結轉移者41例；高、中分化46例，低、未分化31例；Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期29例(根據P-TNM分期)。所有病例在腫瘤切除前均未進行放療和化療。

1.2 組織芯片制作方法 在顯微鏡下找出腫瘤組織切片中有代表性的區域，并在相應石蠟包埋組織切面上做標記。用0.6 mm組織穿刺針在每個標本的標記點分別取樣，而后將其依次排列于模具內預融的石蠟中構成組織微陣列蠟塊，待石蠟凝固后切制3～4 μm組織微陣列切片，將其粘附于玻片上，封蠟，4℃保存。

1.3 免疫組化Elivision兩步法 單克隆兔抗人EGFR抗體為博士德生物公司產品，工作液濃度為1: 100；單克隆鼠抗人ERα抗體為基因科技有限公司產品，工作液濃度為1:100；多克隆兔抗人ERβ抗體為北京Bioss生物技術公司產品，工作液濃度為1:200；即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，用已知陽性切片做陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 對組織芯片中各點評分，根據細胞染色強度和染色細胞所占面積兩者積分之和來判斷。染色強度定性積分為：不著色為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；染色面積定量積分：無著色或＜5%為0，5%～24%為1，25%～50%為2，＞50%為3；兩種積分相加為該點得分。對組織芯片中來自同一病例的各點的得分相加取平均值，依照0為-，1～2為+，3～4為++，5～6為+++，進行半定量判斷；＞2(++和+++)為陽性，≤2(-和+)為陰性進行定性判斷。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件包，臨床病理參數間的比較采用行×列聯表χ2檢驗或Fisher確切概率法、四格表χ2檢驗計算；顯著性檢驗水準α=0.05。ERα、ERβ和EGFR之間的相關關系采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 肺癌進展組織芯片中ERα、ERβ和EGFR的表達差異 ERα陽性著色位于細胞核(圖1)，ERβ陽性著色位于細胞核(圖2)，EGFR陽性著色位于細胞漿/膜(圖3)。ERα和ERβ在癌前病變中的表達高于原發肺癌及淋巴結轉移性肺癌，在原發肺癌中的表達高于淋巴結轉移性肺癌。在癌前病變、原發肺癌和淋巴結轉移性肺癌中ERα和ERβ的表達陽性差異具有統計學意義(P＜0.01)。EGFR蛋白在癌前病變中的表達低于原發肺癌及淋巴結轉移性肺癌，在原發肺癌中的表達低于于淋巴結轉移性肺癌。在癌前病變、原發肺癌和淋巴結轉移性肺癌中EGFR的表達陽性差異具有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

圖1 ERα肺腺癌細胞核陽性表達(Elivision×100)

圖2 ERβ肺鱗癌細胞陽性表達(Elivision×100)

圖3 EGFR肺腺癌細胞漿/膜(Elivision×100)

表1 肺癌進展組織芯片中ERα、ERβ和EGFR的陽性表達率比較[例(%)]

2.2 原發肺癌中ERα、ERβ和EGFR的表達及其與臨床病理學參數的關系 ERα、ERβ和EGFR在77例原發肺癌中的表達陽性見表2。結果顯示，ERα和ERβ的表達與性別有關，在女性中的表達陽性率高于男性(P＜0.05)。ERα和ERβ蛋白的表達還與肺癌的組織學類型有關，在腺癌中的表達高于鱗癌(P＜0.05)，在大細胞癌中的表達低于腺癌和鱗癌，但這種差異無統計學意義(P＞0.05)。ERα和ERβ的表達陽性率隨腫瘤分化程度的升高呈上升趨勢，在腫瘤高、中分化組的表達陽性率高于低、未分化組(P＜0.05)。ERα和ER的表達陽性率隨著P-TNM分期的進展呈下降趨勢，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達陽性率高于于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。ER β的表達與是否有淋巴結轉移有關，在無淋巴結轉移組中的表達陽性率高于有淋巴結轉移組(P＜0.05)。EGFR的表達陽性率與P-TNM分期有關，隨著P-TNM分期的進展呈上升趨勢，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達陽性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。EGFR的表達陽性率在無淋巴結轉移組中的表達低于有淋巴結轉移組(P＜0.05)。ERα的表達陽性率與患者年齡、肉眼類型及腫瘤的淋巴結轉移無關(P＞0.05)。ERβ的表達陽性率與患者年齡和肉眼類型無關(P＞0.05)。EGFR的表達陽性率與患者的性別、年齡、肉眼類型、組織學分型及腫瘤的分化程度無關(P＞0.05)。

表2 ERα、ERβ和EGFR在77例原發肺癌中的表達及其與臨床病理學參數之間的關系

2.3 原發肺癌中ERα、ERβ和EGFR之間的相關性 Spearman等級相關分析顯示，在原發肺癌中，ERβ和EGFR蛋白的表達呈正相關關系(r=0.612，P＜0.01)，ERα和ERβ、ERα和EGFR之間的表達無相關關系(rERα-ERβ=-0.058，P＞0.05；rERα-EGFR=-0.040，P＞0.05)。

3 討 論

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，但是總體治療效果并不滿意。近年來越來越多的研究發現，ER在非小細胞肺癌的發生發展過程中的確起著重要作用[3]。ER有兩種亞型，即ERα和ERβ。ERα在非小細胞肺癌的表達情況在國內外各文獻之間報道的差異較大，細胞核、細胞質均有陽性表達的報道[4]，而表達的陽性率也不同，本研究中ERα蛋白表達于癌前病變、原發肺癌及淋巴結轉移性肺癌的細胞核。與Yun等[5]的報道一致。He等[6]認為在肺癌中不表達全長的ERα，但是檢測到了變異的ERα。這可能是由于不同的檢測方法、不同的抗體及ERα自身的變異造成的。對于ERβ蛋白在肺癌中的定位研究較一致，為細胞核。本研究中ERβ蛋白表達于癌前病變、原發肺癌及淋巴結轉移性肺癌的細胞核。Mah等[7]認為ERβ的表達提示肺癌患者有長期的生存率。本研究結果顯示ERα和ERβ在癌前病變、原發肺癌及淋巴結轉移性肺癌的表達越來越低，隨著腫瘤細胞分化程度的升高而上升，隨著臨床分期的進展而降低(P＜0.05)；ERβ在無淋巴結轉移組的表達明顯高于有淋巴結轉移組(P＜0.05)，提示兩者的失表達可能與腫瘤的惡性進展有關，從另一方面支持了以上說法。McHugh等[8]在分子水平的研究顯示ERα mRNA在肺癌女性患者中的表達明顯高于男性。本研究用免疫組化的方法在蛋白水平得到類似的結果，ERα和ERβ蛋白在肺癌女性患者中的表達明顯高于男性，與Luo等[9]的研究一致。此外，本研究對ERα和ERβ在不同肺癌組織學分型的表達進行了分析，結果顯示在腺癌中的表達高于鱗癌(P＜0.05)，與McHugh等[8]和Luo等[9]的研究相符，提示了ERα和ER β應用于肺癌靶向治療的可能性。

ERβ與ERα在氨基酸序列和配體結合域有同源性，編碼基因所在染色體不同，ERα位于6q25.1，ERβ位于14q23.2。ERα與ERβ在通過增強子元件的信號轉錄過程中介導的配體效應截然不同[10]。本研究結果顯示，ERα和ERβ在肺癌中的表達無相關關系。因此可以推測，ERα和ERβ可能在基因調控中起不同作用。

EGFR屬于細胞表面酪氨酸蛋白激酶受體erbB家族成員，是原癌基因c-erbB-1的表達產物，參與調控細胞代謝、增殖、腫瘤血管生成，促進細胞遷移和分化[11]。本研究發現癌前病變、原發肺癌及淋巴結轉移肺癌中EGFR表達陽性率隨肺癌的進展而升高，EGFR蛋白的表達隨臨床分期的進展而表達升高，在有淋巴結轉移組中的表達與顯著高于無淋巴結轉移組(P＜0.05)，表明其在肺癌的發展及腫瘤細胞的浸潤轉移中起到了促進的作用，對這些指標的檢測有可能為估計患者預后提供重要信息。有文獻報道ER(包括ERα和ERβ)與EGFR之間有相互的作用[12]。這表明他們之間存在著共同的信號通路，而這些信號通路有可能為肺癌的生物學機制提供新的思路。本次試驗發現ERβ與EGFR在肺癌的表達中呈正相關，而ERα與EGFR卻沒有明顯的相關性，推測雌激素誘導的肺癌細胞的增殖可能是通過ERβ來實現的。

總之，雌激素受體ERα和ERβ及EGFR均與非小細胞肺癌的發生發展有關，且ERβ和EGFR的表達相關，這種潛在的機制及關聯性可能為將來的進一步研究提供了基礎。

[1]Nurwidya F,Takahashi F,Takahashi K.Gefitinib in the treatment of nonsmall cell lung cancer with activating epidermal growth factor receptor mutation[J].J Nat Sci Biol Med,2016,7(2):119-123.

[2]Choe C,Shin YS,Kim C,et al.Crosstalk with cancer-associated fibroblasts induces resistance of non-small cell lung cancer cells to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition[J].Onco Targets Ther,2015,8:3665-3678.

[3]Siegfried JM,Stabile LP.Estrogenic steroid hormones in lung cancer [J].Semin Oncol,2014,41(1):5-16.

[4]Gomez-Fernandez C,Mejias A,Walker G,et a1.Immunohistochemical expression of estrogen receptor in adenocarcinomas of the lung: the antibody factor[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2010, 18:137-141.

[5]Yun J,Son CH,Um SJ,et al.A different TRAP220 expression in distincthistologic subtypes of lung adenocarcinoma and the prognostic significance[J].Lung Cancer,2011,71(3):312-318.

[6]He Q,Zhang M,Zhang J，et al.Correlation between epidermal growth factor receptor mutations and nuclear expression of female hormone receptors in non-small cell lung cancer:a meta-analysis[J]. J Thorac Dis,2015,7(9):1588-1594.

[7]Mah V,Marquez D,Alavi M,et al.Expression levels of estrogen receptor beta in conjunction with aromatase predict survival in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2011,74(2):318-325.

[8]McHugh MK,Lopez MS,Ho CH,et al.Use of the cytokinesis-blocked micronucleus assay to detect gender differences and genetic instability in a lung cancer case-control study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2013,22(1):135-145.

[9]Luo Z,Wu R,Jiang Y,et al.Overexpression of estrogen receptor beta is a prognostic marker in non-small cell lung cancer:a meta-analysis [J].Int J Clin Exp Med,2015,8(6):8686-8697.

[10]Takeda S.Δ9-Tetrahydrocannabinol targeting estrogen receptor signaling:the possible mechanism of action coupled with endocrine disruption[J].Biol Pharm Bull,2014,37(9):1435-1438.

[11]Caruso ME,Clément P,Parent S,et al.Integrated cell-based platform to study EGFR activation and transactivation[J].Assay Drug Dev Technol,2013,11(7):423-434.

[12]Wang Z,Li Z,Ding X,et al.ERβ localization influenced outcomes of EGFR-TKI treatment in NSCLC patients with EGFR mutations[J]. Sci Rep,2015,5:11392.

Expression and significance of estrogen receptor α,estrogen receptor β,and epidermal growth factor receptor in human lung cancer by tissue microarray.

CHEN Su-qin,YUAN Hai-hong.Department of Pathology,the People's Hospital of Wuqing District of Tianjin,Tianjin 301700,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and biological significances of estrogen receptor α(ERα), estrogen receptor β(ERβ),and epidermal growth factor receptor(EGFR)in lung cancer.MethodsWe constructed a tissue microarray in which there were 12 cases of precancerous lesion,77 cases of primary lung cancer,and 12 cases of lung cancer with lymph node metastasis,and detected the expression of ERα,ERβ and EGFR in these specimens by using Elivision immunohistochemical method.ResultsThe positive rate of ERα was 91.67%in precancerous tissues, 62.34%in primary lung cancer and 25.00%in lung cancer with lymph node metastasis,and there were significant differences among them(P＜0.01).The positive rate of ERβ was 91.67%in precancerous tissues,55.84%in primary lung cancer and 16.67%in lung cancer with lymph node metastasis,and the differences were statistically significant(P＜0.01). The positive rate of EGFR was 25.00%,59.74%,and 91.67%,respectively,and the differences among them were significant(P＜0.01).In primary lung cancer,the expression of ERα was significantly correlated with gender,histological types,grade and P-TNM stage(P＜0.05),and the expression of ERβ was significantly correlated with gender,histological types,grade,P-TNM stage and lymph node metastasis(P＜0.05).The expression of EGFR was significantly correlated with lymph node metastasis and P-TNM stage(P＜0.05).Correlation analysis showed that there was a positive correlation between ERβ and EGFR(r=0.612,P＜0.01).ConclusionThe expression of ERα,ERβ and EGFR are related to the occurrence and development of lung cancer,and the expression of ERβ is correlated with EGFR.The underlying mechanism and potential translational relevance provide the foundation for further investigation.

Tissue microarray;Immunohistochemical;Lung cancer;Estrogen receptor α(ERα);Estrogen receptor β(ERβ);Epidermal growth factor receptor(EGFR)

R734.2

A

1003-6350（2017）04-0521-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.002

2016-09-19)

天津市武清區科技發展計劃項目（編號：WQKJ201214）

陳素琴。E-mail：sukeyar@163.com