胰島素樣生長因子-1在大鼠重癥急性胰腺炎中的作用

王力波，楊志文，王靜，翁成釗，徐萍

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600)

·論 著·

胰島素樣生長因子-1在大鼠重癥急性胰腺炎中的作用

王力波1，楊志文2，王靜2，翁成釗2，徐萍2

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600)

目的 觀察胰島素樣生長因-1(IGF-1)在重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠中的治療作用。方法將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、假手術(shù)組、SAP組、高劑量IGF-1組和低劑量IGF-1組，每組6只。采用改良的Aho法制作SAP模型，在造模6 h后處死大鼠，收集胰腺組織、外周血和腹水。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠血清細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)表達(dá)。Real-time PCR方法檢測胰腺組織(TLR-4、MAPK p38、NF-κB p65) mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平變化。結(jié)果SAP組大鼠腹水量、轉(zhuǎn)氨酶、血清及腹水淀粉酶和炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6較正常對照組及假手術(shù)組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)IGF-1干預(yù)后，大鼠腹水量、轉(zhuǎn)氨酶、血清及腹水淀粉酶、IL-1β和IL-6較SAP組明顯下降，且隨IGF-1劑量的增加，大鼠腹水量、轉(zhuǎn)氨酶、血清及腹水淀粉酶、IL-1β和IL-6下降更加顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論IGF-1能有效減輕SAP大鼠胰腺炎的病情。

胰島素樣生長因-1；重癥急性胰腺炎；大鼠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床常見的危重病癥，有發(fā)病急、發(fā)展迅速、病情兇險、并發(fā)癥多、病死率高等特點[1]。盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，SAP的臨床治愈好轉(zhuǎn)率逐年提高，但其總體死亡率仍高達(dá)15%左右[2]。目前認(rèn)為SAP的發(fā)病始于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并促發(fā)機(jī)體產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)[3]，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能衰竭(MODF)。p38MAPK是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及通過應(yīng)急反應(yīng)刺激誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、分化及炎癥反應(yīng)等[4]，激活p38MAPK后可促進(jìn)白介素-1β(IL-1β)、白介素-6 (IL-6)等炎癥因子的大量釋放，與SAP病情的進(jìn)展關(guān)系緊密。有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)與p38MAPK信號通路可能存在著交互作用[5，6]。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是由70多個氨基酸組成的單鏈多肽,具有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，促進(jìn)細(xì)胞增殖等多種作用，本研究旨在初步研究IGF-1在重癥急性胰腺炎大鼠中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g，由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物實驗中心提供；牛磺膽酸鈉(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；胰島素樣生長因子IGF-1(Sigma，美國)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，美國)；第一鏈cDNA合成試劑盒(大連寶生，美國)；ABI 7500型定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立 30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為：正常對照組、假手術(shù)組、SAP組、高劑量IGF-1組，低劑量IGF-1組，每組6只。SAP組以1 mL/kg體質(zhì)量的5%牛磺膽酸鈉經(jīng)大鼠胰膽管逆行注射的方法制作。假手術(shù)組翻動大鼠胰腺并以鈍器輕微劃動胰腺3次后關(guān)腹。低劑量IGF-1組造模同SAP組并于術(shù)前30 min及術(shù)后30 min分別皮下注射20μg/kg IGF-1，高劑量IGF-1組造模同SAP組并于術(shù)前30 min及術(shù)后30 min按分別皮下注射200μg/kg IGF-1。正常對照組、假手術(shù)組、SAP組、高劑量IGF-1組、低劑量IGF-1組6 h后分別處死6只大鼠并立即心臟取血，收集腹水標(biāo)本記錄腹水量，收集大鼠胰腺組織。

1.2.2 標(biāo)本處理 收集的血液，4℃冰箱靜置3 h后以3 000 r/min離心10 min后取血清分成兩部分，一部分存于-80℃冰箱中用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，一部分送檢測定血清淀粉酶、LDH、轉(zhuǎn)氨酶。大鼠胰腺組織分成兩部分，一部分置于-196℃液氮罐保存，用于胰腺病理檢測，一部分用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測。

1.2.3 病理檢測 取部分胰腺組織10%甲醛液固定后切成4μm厚的切片，常規(guī)HE染色。胰腺組織常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織病理改變，每片隨機(jī)選取8～10個高倍視野，采用Schimidt等[7]標(biāo)準(zhǔn)從水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、出血和脂肪壞死程度4個方面進(jìn)行評分，4個評分相加為總評分。

1.2.4 Real-time PCR 外周血總RNA提取及TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 IGF-1R mRNA表達(dá)檢測，按Trizol提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR在7300實時熒光定量PCR儀(ABI)上進(jìn)行，采用兩步法，進(jìn)行引物擴(kuò)增。檢索NCBI網(wǎng)站GeneBank查詢TLR4、p38MAPK、NF-κB p65、IGF-1R mRNA及GAPDH的mRNA序列。利用Primer Express軟件設(shè)計引物，TLR4上游引物：5'ATGCTAAGGTTGGCACTCTC3'，下游引物5'CAGGCAGGAAAGGAACAATG3'；NF-κB p65上游引物5'AGACCTGGAGCAAGCCATTAG3'，下游引物5'CGGACCGCATTCAAGTCATAG3'；p38MAPK上游引物5'TTCCCAGCAGTCCTATCC3'，下游引物5'CAGATGGCAAGGGTTCAG3'；GAPDH上游引物5'GTCGGTGTGAACGGATTTG3'，下游引物5'TCCCA TTCTCAGCCTTGAC3'；IGF-1R上游引物5'CGCAGG ATGGCTATCTGTTC3'，下游引物5'ATCACCACCGC ACACTTC3'。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10 min，然后按95℃15 s，60℃60 s，進(jìn)行40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，將目的基因Ct值減去內(nèi)參Ct值作為△Ct值，不同標(biāo)本采用2-△△Ct值進(jìn)行比較，表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 血清細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)表達(dá)水平的檢測 采用ELISA檢測血清炎癥因子(IL-1β、IL-6)的水平，抗大鼠IL-1β、IL-6單抗包被于酶標(biāo)板上標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-1β、IL-6會與單抗結(jié)合，洗去游離的成分，加入生物素化的抗大鼠IL-1β、IL-6抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素生物素與親和素特異性結(jié)合；抗大鼠IL-1β、IL-6抗體與結(jié)合在單抗上的大鼠IL-1 β、IL-6結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，37℃避光顯色15 min，以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出標(biāo)本濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為標(biāo)本中IL-1β、IL-6的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism5軟件作圖。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，偏態(tài)分布采用M(P25，P75)表達(dá)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間比較采用非參數(shù)檢驗Mann Whitney分析，胰腺組織病理損傷及評分、胰腺組織TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化、胰腺組織IGF-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化、ELISA檢測比較采用單因素方差分析(LSD)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腹水量、血清及腹水淀粉酶水平觀察 SAP組大鼠術(shù)后6 h的腹水量、血清及腹水淀粉酶、血清轉(zhuǎn)氨酶水平較假手術(shù)組和正常對照組明顯增高(P＜0.05)；注射低劑量IGF-1后的同時段的腹水量、血清及腹水淀粉酶、血清轉(zhuǎn)氨酶水平較SAP組降低(P＜0.05)，見表1。注射高劑量IGF-1后同時段的血清、腹水淀粉酶水平、血清轉(zhuǎn)氨酶較SAP組降低(P＜0.05)，也較低劑量IGF-1組低(P＜0.05)。

2.2 胰腺組織病理損傷及評分 胰腺組織病理：正常對照組(圖1A)大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，未見間質(zhì)充血、出血和腺泡細(xì)胞壞死。假手術(shù)組(圖1B)大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，絕大部分腺泡小葉完整，偶見炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，未見腺泡細(xì)胞壞死。SAP組(圖1C)大鼠胰腺組織可見腺泡細(xì)胞變性、壞死明顯增多，小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，間隔間隙增大，細(xì)胞間隙水腫，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤增多，且病理評分顯著增高。注射低劑量IGF-1后(圖1D)的胰腺病理損傷較SAP組好轉(zhuǎn)，腺泡細(xì)胞變性、壞死稍有減少，小葉結(jié)構(gòu)破壞仍明顯，間隔間隙增大，細(xì)胞間隙水腫，有紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，評分均較SAP組降低(P＜0.05)。注射高劑量IGF-1后(圖1E)的胰腺病理損傷顯著減輕，其細(xì)胞壞死、小葉結(jié)構(gòu)破壞、紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤均明顯減輕，其評分均較SAP組、低劑量治療組顯著降低(P＜0.05)。圖1示各組病理切片，表2示各組病理評分。

表1 各組大鼠腹水量、血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清AST、血清ALT(±s)

表1 各組大鼠腹水量、血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清AST、血清ALT(±s)

注：SAP組、低劑量IGF-1組、高劑量IGF-1組vs正常對照組和假手術(shù)組：aP＜0.05；低劑量IGF-1組、高劑量IGF-1組vs SAP組：bP＜0.05，高劑量IGF-1組vs低劑量IGF-1組：CP＜0.05。以M(P25，P75)表示。

組別正常對照組假手術(shù)組SAP組低劑量IGF-1組高劑量IGF-1組腹水量(mL) / 1.66±0.33 9.75±0.77a5.66±0.69ab5.67±0.84abAMS(IU/L) 340.00(148.50，827.75) 643.00(606.75，420.50) 31 398.00(24 265.00，38 429.00)a24552.50(17 219.25，38 478.25)ab24394.0(21 801.50，30 171.00)abc腹水淀粉酶(IU/L) / 1354.33±119.98 5083±526.42a 4567.8±168.47ab4267.4±119.42abcAST(IU/L) 134.57±16.00 164±8.33 749.75±133.95a537.4±145.89ab358±65.43abcALT(IU/L) 53.38±4.38 49±1.77 311±107.45a226.2±88.18ab120.67±23.67abc

圖1 胰腺病理(×200)

表2 各組大鼠胰腺組織病理評分(±s)

表2 各組大鼠胰腺組織病理評分(±s)

注：SAP組、低劑量IGF-1組、高劑量IGF-1組vs正常對照組和假手術(shù)組：aP＜0.05;低劑量IGF-1組、高劑量IGF-1組vs SAP組：bP＜0.05，高劑量IGF-1組vs低劑量IGF-1組：cP＜0.05。

組別正常對照組假手術(shù)組SAP組低劑量IGF-1組高劑量IGF-1組胰腺病理評分0.65±0.50 1.10±0.50 11.71±1.01a8.60±0.68ab6.15±1.95abc

2.3 胰腺組織TLR4、p38MAPK、NF-κ B p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化 SAP組胰腺組織的TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(P＜0.05)，低劑量IGF-1組胰腺組織的TLR4、p38MAPK、 NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較SAP組降低(P＜0.05)，見圖2，注射高劑量IGF-1后同時段的TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較SAP組降低(P＜0.05)，高劑量IGF-組后同時段TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平也較低劑量IGF-1組低(P＜0.05)。

2.4 胰腺組織IGF-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化 SAP組術(shù)后6 h的IGF-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平較假手術(shù)組和正常對照組明顯下降，正常對照組與SAP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；注射不同濃度IGF-1后，隨注射濃度提高，IGF-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，低劑量組及高劑量組與SAP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖2 胰腺組織TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖3 胰腺組織IGF-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平

2.5 ELISA檢測 SAP組大鼠術(shù)后6 h的細(xì)胞因子IL1-β、IL-6水平較正常對照組和假手術(shù)組明顯增高(P＜0.05)；注射低劑量IGF-1后IL1-β、IL-6較SAP組降低(P＜0.05)(表3)，注射高劑量IGF-1后IL1-β、IL-6較SAP組降低(P＜0.05)，也較低劑量IGF-1組低(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)

3 討 論

IGF-1是由70多個氨基酸組成的單鏈堿性蛋白，編碼基因位于第12號染色體，分子量7 648，主要由肝細(xì)胞分泌和合成，是生長因子大家族中的一員。IGF-1對機(jī)體生長發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用，且在缺血后再灌注等多種病理狀態(tài)下對機(jī)體發(fā)揮重要的保護(hù)作用[8]。危重患者中，創(chuàng)傷應(yīng)激性反應(yīng)使分解代謝加快，炎癥/抗炎性細(xì)胞因子比例隨血清IGF-1水平降低而逐漸升高，從而增加患者多器官衰竭發(fā)生的風(fēng)險[9]。同時，肝合成IGF-1速度與營養(yǎng)素成正相關(guān)，當(dāng)發(fā)生重癥急性胰腺炎時機(jī)體處于負(fù)氮平衡，導(dǎo)致IGF-1合成減少，本研究也發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎大鼠模型IGF-1受體水平下降，這與以往研究是一致的。

p38MAPK、NF-κB等細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路由于能調(diào)控炎癥反應(yīng)，近年來在SAP發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視。大量研究顯示NF-κB、p38MAPK等通路的激活可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，并促發(fā)炎癥的級聯(lián)瀑布反應(yīng)。Gray等研究發(fā)現(xiàn)敲除NF-κB基因的大鼠能夠較好的抵抗雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎[10]；Samuel等通過結(jié)扎主胰管的方法建立大鼠AP模型，采用免疫印跡法檢測胰腺組織p38MAPK表達(dá)，結(jié)果顯示造模后大鼠胰腺組織中p38MAPK活性明顯增加[11]。

Ghrelin能夠促進(jìn)生長激素(growth hormone，GH)分泌，而目前研究發(fā)現(xiàn)GH、IGF-1對急性胰腺炎有明確的治療作用，Ceranowicz等[12]研究發(fā)現(xiàn)切除垂體的胰腺炎模型大鼠，IGF-1對其治療效果與Ghrelin治療效果大鼠類似，且Ghrelin對胰腺炎的治療作用是間接的，依賴于生長激素和IGF-1的釋放。而目前也有研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin可通過抑制NF-κBp65表達(dá)減輕急性胰腺炎[13]；通過抑制p38通路而間接抑制TNF-a表達(dá)[14-15]。故筆者推測IGF-1可能作用于NF-κB通路和MAPK通路，使這兩條通路活化程度減弱，從而減輕急性胰腺炎病情。

本研究發(fā)現(xiàn)：急性胰腺炎模型大鼠注射IGF-1后，大鼠血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清轉(zhuǎn)氨酶AST、血清ALT、大鼠腹水量、病理損傷及評分均明顯下降，且隨著IGF-1注射濃度升高，下降更明顯；說明注射IGF-1 SAP模型大鼠后，SAP模型大鼠炎癥能夠減輕。

急性胰腺炎模型大鼠注射IGF-1后，隨著IGF-1注射濃度升高，大鼠胰腺組織TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平SAP組降低，隨著IGF-1注射劑量增加，TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較SAP組降低的更明顯。從以上結(jié)果我們可以得出IGF-1使急性胰腺炎大鼠炎癥減輕可能作用于NF-κB通路和MAPK通路，使這兩條通路活化程度減弱，而在N-κB通路上，可能通過TLR4表達(dá)減少從而使NF-κB通路活化程度減弱。

綜上所述，IGF-1可能通過抑制NF-κB p65和p38表達(dá)，從而使這兩條通路活化程度減弱，TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，IL-1β、IL-6等炎癥因子釋放減少，從而減輕急性胰腺炎病情，其具體機(jī)制需進(jìn)一步探討研究。

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Effects of insulin-like growth factor-1 in the treatment of severe acute pancreatitis.

WANG Li-bo1,YANG Zhi-wen2, WANG Jing2,WENG Cheng-zhao2,XU Ping2.1.Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA;2. Department of Gastroenterology,Shanghai Songjiang District Central Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Shanghai 201600,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of insulin-like growth factor-1(IGF-1)in the treatment of severe acute pancreatitis(SAP).MethodsThirty SD rats were randomly divided into five equal groups(n=6 each):normal group,sham operation group,SAP group,high dose IGF-1 group and low dose IGF-1 group.The SAP model was established by the modified Aho method.Rats were sacrificed 6 h after modeling for collection of pancreatic tissues,peripheral blood and ascites.The expression status of the serum cytokines(IL-1β,IL-6)was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Real-time PCR was used to detect the changes in TLR-4,MAPK p38 and NF-κB p65 mRNA and protein levels in pancreatic tissues.ResultsIn the SAP group,there were significant increases in ascites volume, transaminases,serum and ascites amylase,IL-1β and IL-6,compared with those in the normal group and control group (P＜0.05).IGF-1 intervention resulted in significant decreases in ascites volume,transaminases,serum and ascites amylase,IL-1βand IL-6,compared to those in the SAP group,and there were greater decreases in ascites volume,transaminases,serum and ascites amylase,IL-1β and IL-6 with increasing IGF-1 dose(P＜0.05).ConclusionIGF-1 could effectively alleviate pancreatitis in SAP rats.

Insulin-like growth factor-1;Severe acute pancreatitis;Rats

R-332

A

1003-6350（2017）04-0517-05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.001

2016-09-12)

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金資助基金(編號：2012-III-58）

徐萍。E-mail：sjzxxp@yeah.net