43株甘肅臨床分離非結核分枝桿菌分類鑒定

張 鑫，蔡 靜，姜 元，魏黛玨，李 凱，同重湘

43株甘肅臨床分離非結核分枝桿菌分類鑒定

張 鑫，蔡 靜，姜 元，魏黛玨，李 凱，同重湘

目的 了解甘肅當前臨床流行的非結核分枝桿菌(NTM)的病原譜特點及其主要NTM種類，為指導臨床診療、有效防治NTM肺病提供參考依據。方法 收集2012年～2014年來源于甘肅省不同地區的875株臨床分離分枝桿菌菌株，經PNB/TCH方法初步鑒定為疑似NTM菌株，采用16S rRNA基因測序技術進行菌種鑒定。結果 875株分枝桿菌臨床分離菌株中分離出疑似NTM菌株46株。經16S rRNA基因序列分析鑒定，43株為NTM，3株為諾卡氏菌。43株NTM菌株分別為胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、塞內加爾分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登氏分枝桿菌、楚爾蓋分枝桿菌、罕見分枝桿菌、偶然分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。其中，胞內分枝桿菌有31株，占總NTM菌株數的72.09%。結論 甘肅省非結核分枝桿菌群以胞內分枝桿菌為主，應用16S rRNA基因序列分析鑒定方法能準確鑒定出NTM菌種，為臨床診治提供依據。

非結核分枝桿菌；PNB/TCH鑒別培養；16S rRNA基因序列分析

非結核分枝桿菌(Non-tuberculousMycobacteria，NTM)是除結核分枝桿菌類群和麻風分枝桿菌之外的一類分枝桿菌，廣泛存在于各種自然環境中，目前已發現170多種[1-2]。NTM是一類致病菌或條件致病菌[3-4]，近年來由NTM引起的疾病疫情逐漸呈上升趨勢，現已引起全世界范圍的普遍關注[5-6]。NTM感染與結核病具有相似的臨床表現，但其預防治療與結核病卻明顯不同，這對于臨床診斷的準確性帶來極大考驗[7]。所以，臨床分枝桿菌感染的菌種鑒定的準確性，對于治療肺部感染等疾病具有重要的參考和指導依據[8]。因此，本研究收集了2012-2014年來自甘肅省不同地區就診于蘭州市肺科醫院臨床分離的875株分枝桿菌菌株，采用PNB/TCH生長試驗方法初步篩選出疑似NTM的菌株，采用16S rRNA基因序列分析進行菌種鑒定，以便了解甘肅地區NTM病原譜型分布和優勢菌種，為NTM疫情的預防控制提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2012-2014年蘭州市肺科醫院經Bactec MGT960系統培養陽性分枝桿菌菌株875株。結核分枝桿菌標準參考菌株H37Rv由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 培養基 菌株培養采用改良羅氏培養基(L-J培養基)，菌株鑒定培養基采用PNB/TCH鑒別培養基，均由珠海市銀科醫學工程股份有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 細菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，DNA膠回收純化試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，ExTaqDNA聚合酶(大連 TaKaRa)，PCR儀(美國 Bio-Bad)，凝膠成像儀(美國 Bio-Bad)。

1.2 研究方法

1.2.1 NTM菌株篩選 將經Bactec MGT960系統培養陽性的875分枝桿菌菌液接種于PNB培養基、TCH培養基及L-J培養基上，37 ℃培養4周，記錄菌落的生長情況。其中PNB和TCH培養基均生長的菌株初步判定為非結核分枝桿菌；PNB不生長、TCH生長或不生長的菌株初步判定為結核分枝桿菌復合群[9]。

1.2.2 菌株DNA提取及16S rRNA基因片段PCR擴增 將上述初步篩選出的疑似NTM菌株接種于L-J液體培養基中，37 ℃培養至生長對數期，在6 000 r/min離心10 min，留菌體沉淀，采用細菌基因組提取試劑盒提取DNA。引物由上海生工生物有限公司合成(上游引物：5′-GCTGGCGGCGTGCTTAACA-3′，下游引物：5′-ATGACGTGACGGGCGGTGT -3′)，以提取總DNA為模板，對其16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR擴增反應總體系為25 μL：上下游引物各(10 μmol/μL) 1 μL，模板 2 μL，Premix ExTaqDNA聚合酶12.5 μL，補加ddH2O至25 μL。反應參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環，最后72 ℃總延伸10 min。PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，并用DNA膠回收試劑盒進行切膠回收純化，將純化后的PCR擴增產物送至華大基因公司測序。

1.2.3 16S rRNA基因序列系統發育分析 獲得測序結果后提交序列，將所測序列在NCBI的GenBank數據庫中，用BLAST程序與已知序列進行同源性比對分析。并定義16S rRNA基因序列相似性低于97%劃分為不同的分類單元(OTU)[10]。利用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining方法進行系統發育樹的構建(自展值為1 000次)。

2 結 果

2.1 PNB/TCH鑒別培養結果 經采用PNB/TCH生長試驗方法對875株分枝桿菌菌株初步篩選鑒定，其中在PNB/TCH培養基均生長的菌株有46株，初步鑒定為NTM菌群；PNB培養基上不生長、TCH培養基上生長或不生長的菌株有829株，鑒定為結核分枝桿菌復合群。

2.2 NTM菌株DNA提取及16S rRNA基因擴增 將上述初步鑒定為NTM菌株進行總DNA基因組的提取，并用1%凝膠瓊脂糖進行電泳檢測(如圖1A)。可以看出，NTM菌株提取的DNA基因組片段長度都均約在23.1 kb左右，完整性較好。PCR擴增產物長度約為580 bp左右，且目的條帶單一，具有較好的擴增效果(圖1B)。

注：A圖中M為λDNA/ HindⅢMarker；B圖中M為DNA Marker DL2000.A: M is λDNA/ HindⅢ Marker; B: M is DNA Marker DL2000.圖1 部分NTM菌株的總DNA提取(A)和16S rRNA基因片段的PCR擴增電泳檢測圖(B)Fig.1 Partial results of strain NTM total DNA extraction (A) and 16S rDNA gene PCR amplification electrophoresis figure (B)

2.3 16S rRNA基因序列分析 通過16S rRNA基因序列同源性比對結果分析顯示，46株疑似NTM菌株中43株為NTM菌株，3株為諾卡氏菌。其中，43株NTM菌株中有31株屬于胞內分枝桿菌(M.intracellulare)，占NTM菌株總數的72.09%；3株為堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)，占NTM菌株總數的6.97%；鳥分枝桿菌(M.avium)、塞內加爾分枝桿菌(M.senegalense)和戈登氏分枝桿菌(M.gordonae)均為2株；楚爾蓋分枝桿菌(M.szulgai)、罕見分枝桿菌(M.peregrinum)和偶然分枝桿菌(M.fortuitum)均為1株。其中，胞內分枝桿菌(M.intracellulare)為NTM菌株類群的優勢種群(見表1)。

表1 16S rRNA基因序列相似性分析鑒定NTM菌種結果
Tab.1 Results of NTM species identification with similarity analysis of partial 16S rRNA gene sequences

菌株Strain代表菌株編號Representativestrainnumber菌株數Numberofstrains同源序列Homologoussequences同源相似性(%)ThesimilarofHomologous(%)比例(%)Proportion(%)胞內分枝桿菌M.intracellulareS131S.flavogriseus(KF991636)98.2,99.472.09堪薩斯分枝桿菌M.kansasiiS23S.xantholiticus(EU570689)98.4,99.76.97鳥分枝桿菌M.aviumS32M.avium(LT558822)98.3,99.84.65塞內加爾分枝桿菌M.senegalenseS42S.niveoruber(EU570685)98.5,99.44.65戈登氏分枝桿菌M.gordonaeS52S.bacillaris(KC493993)99.1,99.34.65楚爾蓋分枝桿菌M.szulgaiS61S.europaeiscabiei(HQ441821)99.62.33罕見分枝桿菌M.peregrinumS71S.griseoplanus(KF876898)99.82.33偶然分枝桿菌M.fortuitumS81S.roseus(EF017710)98.92.33

圖2 基于16S rRNA基因序列構建的代表菌株的系統發育樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of reference strains

3 討 論

在臨床醫學上，以生理生化特性試驗為主的菌種鑒定技術是分枝桿菌菌種鑒定的主要方法，但其由于操作的復雜性和耗時等缺點，鑒定結果也不準確。目前，隨著分子生物學技術的快速發展，人們對于NTM的研究也不斷深入，基于基因技術對NTM菌株進行鑒定已成為快速檢測分枝桿菌的重要手段。通過研究發現，分枝桿菌的16S rRNA基因片段中含有保守區和高變區，兩區特定位置上的核苷酸差異可將分枝桿菌鑒定至種水平[11-12]。采用16S rRNA基因擴增技術，只需對NTM的16S基因進行擴增測序并與基因數據庫中的同源序列進行對比分析，就能快速的進行菌種鑒定[13]。因此，在臨床上分枝桿菌菌株的快速準確鑒定至種水平對于分枝桿菌感染的流行病學和臨床診斷治療都具有十分重要的意義[14]。

近年來，有關于我國NTM感染的報道研究較多，且逐年呈上升趨勢[15]。但從總的趨勢上來說，國內NTM流行分布主要為南方地區高于北方地區，沿海地區高于內地地區，氣候溫和地區高于寒冷地區等特點[16]。而本研究中NTM的臨床分離率為4.83%，遠低于福建省NTM和寧波地區NTM流行狀況調查分析臨床分離率的10.2%和17.48%[16-17]，這也正好符合我國NTM流行的分布特征。本研究通過NTM菌株的16S rRNA基因片段序列分析，結果顯示：從875株臨床分離株中鑒定出46株疑似NTM菌株，通過16S rRNA基因序列分析鑒定，43株為NTM菌株和3株諾卡菌，其中胞內分枝桿菌有31株，占NTM總數的72.09%，這與2012年湖南地區225株NTM基因芯片分型結果主要以胞內分枝桿菌為主的研究結果相近[18]。由于胞內分枝桿菌是屬于一種致病性的NTM菌株，分布范圍較廣。它主要可以引起慢性肺部感染，繼發感染于AIDS患者的情況則尤為突出，呈播散性感染。但近幾年來，研究學者們發現，結核肺病的主要病原體是胞內分枝桿菌，也是引發人肺結核病的重要病原菌之一。因此，由胞內分枝桿菌引起的疾病已引起了全世界范圍內的極大關注。本研究NTM菌株鑒定結果中有3株為諾卡菌，這說明部分諾卡菌感染與結核病具有相似的臨床表現。這也印證了傳統培養方法鑒定的不準確性，而采用16S rRNA基因擴增技術進行菌種鑒定對于分枝桿菌感染的臨床診斷治療更具有準確性。另外，本研究還發現，本省各地區常見NTM菌群與我國類似，優勢菌群順位有一定差異，但未深入進行研究其地理分布信息差異，今后需進一步深入研究。

[1] Xu JG. The scene of bacteriology[M]. BeiJing: Science Press Co. Ltd. 2011: 250 (in Chinese)

徐建國. 現場細菌學[M]. 北京: 科學出版社, 2011: 250.

[2] Senna SG, Duarte RS, Fonseca LS, et al. Sequencing of hsp65 gene for identification ofMycobacteriumspecies isolated from environmental and clinical sources in Rio de janeiro, Brazil[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(11): 3822-3825. DOI: 10.1128/JCM.00451-08

[3] Wang HX, Yue J, Han M, et al. NontuberculousMycobacterial: susceptibility pattern and prevalence rate in Shanghai from 2005 to 2008[J]. Chin Med J(Engl), 2010, 123(2): 184-187. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2012.03818.x

[4] Cassidy PM, Hedberg K, Saulson A, et al. NontuberculousMycobacterialdisease prevalence and risk factors: a changing epidemiology[J]. Clin Infect dis Dis, 2009, 49(12): 124-129. DOI: 10.1086/648443

[5] Roth A, Reischl U, Streubel A, et al. Novel diagnostic algorithm for identification ofMycobacteriausing genus specific am plification of the 16S-23S rRNA gene spacer and restriction endonucleases[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1094-1104. DOI: 0095-1137/00/S04.00

[6] Stephen K, Robert L. Lung disease due to the more common nontuberculous Mycobacteria[J]. Chest, 2006, 129(6): 1653-1672. DOI: 10.1109/TMAG.2004.830237

[7] Beggs ML, Stevanova R, Eisenach KD. Species identification ofMycobacteriumaviumcomplex isolat es by a variety of molecular techniques[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(2): 508-512. DOI: 10.1149/1.1498016

[8] Stach JE, Maldonado LA, Masson DG, et al. Statistical approaches for estimating actinobacterial diversity in marine sediments[J]. Appl Environmental Microbiol, 2003, 69(2): 6189-6200. DOI: 10.1128/AEM.69.10.6189-6200.2003

[9] Lian LL, Jiang Y, Zhao XQ, et al. Identification of 44 suspicious clinical isolates of non-tuberculosisMycobacteriain Gansu, China[J]. Chin J Zoonoses. 2013, 29(4): 343-347 (in Chinese)

連璐璐, 姜元, 趙秀芹, 等. 44株甘肅疑似非結核分枝桿菌臨床分離株的菌種鑒定[J]. 中國人獸共患病學報, 2013, 29(4): 343-347.

[10] Pitulle C, Dorsch M , Kazda J, et al. Phylogeny of rapidly growing members of the genusMycobacterium[J]. Int J Syst Bacteriol, 1992, 42(3): 337-343. DOI: 10.1099/00207713-42-3-337

[11] Dong B, Wang M. Analysis of non-tuberculosisMycobacterialung disease and tuberculosis clinical characteristics[J]. Modern Practical Medicine, 2016, 4(28): 546-547 (in Chinese)

董波, 王冕. 非結核分枝桿菌肺病與肺結核臨床特征對比分析[J]. 現代實用醫學，2016, 4(28): 546-547.

[12] Wen BH. Analysis ofrickettsial16s RNA genes[J]. Chinese Journal of Zoonoses. 1999, 15(6): 18-20 (in Chinese)

溫博海. 立克次體的16S rRNA 基因序列分析[J]. 中國人獸共患病雜志, 1999, 15(6): 18-20.

[13] Pan AZ, Wang BB. Analysis of pathogen spectrum of non tuberculosisMycobacteriain Zhejiang province[J]. Chin J Health Lab Tec, 2015, 25(24):4298-4300 (in Chinese)

潘愛珍, 吳蓓蓓. 浙江省非結核分枝桿菌病原譜的分析[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25(24):4298-4300.

[14] Peng T, Wen BH. Analysis ofMycobacteriumof 16 s rRNA gene sequence [J]. Chin J Zoonoses. 2004, 20(9): 772-776 (in Chinese)

彭濤, 溫博海. 分枝桿菌臨床分離株16S rRNA基因序列分析[J]. 中國人獸共患病雜志, 2004, 20(9): 772-776.

[15] Wang ZR, Zhang ZD, Zhang B. The popular trend of non-tuberculosisMycobacterialdiseases[J]. Chin J Tuberculosis and Respiratory Diseases, 2000, 23(5): 263-265.

王忠仁, 張宗德, 張本. 非結核分枝桿菌病的流行趨勢[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2000, 23(5): 263-265.

[16] Huang MX, Wan KL, Chen LZ, et al. Distribution of nontuberculousMycobacteriaof clinicalMycobacteriumisolates from Fujian Province, China[J]. Chinese Journal of Zoonoses. 2014, 30(12): 1227-1230 (in Chinese)

黃明翔, 萬康林, 陳力舟, 等. 福建省臨床分離非結核分枝桿菌菌種分布研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(12): 1227-1230.

[17] Che Y, Yu M, Pin GH. Analysis on the current situation of non-tuberculosismMycobacteriumin Ningbo[J]. Chin J Health Laboratory Technology. 2012, 22(11): 2766-2770 (in Chinese)

車洋, 于梅, 平國華. 寧波地區非結核分枝桿菌流行狀況分析[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2012, 22(11):2766-2770.

[18] Qi ZQ, Xiang YG, Tang AG, Gene chips typing and drug sensitivity analysis of 225 cases of non-tuberculousMycobacteria[J].J Clinical Pulmonary Medicine.2014, 19(1):105-106.

齊志強, 向延根, 唐愛國, 等. 225 株非結核分枝桿菌基因芯片分型及藥敏分析[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19(1):105-106.

Species identification on 43 clinical non-tuberculosisMycobacteriaisolates from Gansu Province, China

ZHANG Xin, CAI Jing, JIANG Yuan, WEI Dai-jue, LI Kai, TONG Chong-xiang

(LanzhouPulmonaryHospital,Lanzhou730046,China)

To understand pathogen spectrum of nontuberculosisMycobacteria(NTM) and the dominant NTM in Gansu Province and provide the scientific basis for the effective prevention and treatment of NTM diseases, 875Mycobacteriaisolates were collected from 2012 to 2014 in Lanzhou Pulmonary Hospital, NTM species were identified by means of PNB/TCH differentiate medium and 16S rRNA gene sequence analysis respectively.Forty-six isolats of NTM were identied from 875 PNB/TCH.Then with 16S rRNA gene sequence analysis,the NTM strains were identified to 3 strains ofNocadiaand 43 strains of NTM, includingM.intracellulare,M.kansasii,M.avium,M.senegalense,M.gordonae,M.szulgai,M.peregrinumandM.fortuitum. Among them, there were 31 strains ofM.intracellulare, which accounted for 72.09% of the total number of NTM strains. The dominant nontuberculosisMycobacteriain Gansu Province were mainlyM.intracellulare. The application of molecular biology can rapidly and accurately identify the species of nontuberculosisMycobacteria, and can provide relevant evidence for clinical diagnosis and therapy.

non-tuberculosisMycobacteria; PNB/TCH; 16S rRNA gene sequence analysis

Tong Chong-xiang, Email: 1607128879@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.015

同重湘，Email：1607128879@qq.com

甘肅省蘭州市肺科醫院，蘭州 730046

R378

A

1002-2694(2017)02-0173-05

2016-11-07 編輯：張智芳

蘭州市科技計劃項目(No.2014-ZD-01)資助

Funded by the Science and Technology Project of Lanzhou (No. 2014-ZD-01)