qRT-PCR檢測結核分枝桿菌毒素-抗毒素系統mazE F的表達

劉 微，趙繼利，屈艷琳，謝婉瑩，袁 俐

qRT-PCR檢測結核分枝桿菌毒素-抗毒素系統mazE F的表達

劉 微，趙繼利，屈艷琳，謝婉瑩，袁 俐

目的 探討結核分枝桿菌毒素基因mazF3,6,9及抗毒素基因mazE3,6,9的表達差異。方法 運用實時定量PCR檢測結核分枝桿菌單耐藥株20株，耐多藥株20株和標準株H37Rv毒素基因mazF3,6,9及抗毒素基因mazE3,6,9的表達水平；組間基因表達水平的差異用one-way ANOVA進行統計分析。結果 與對照株相比較，毒素基因mazF6,9在單耐藥組(11.151 9±22.317 21；8.430 6±17.978 97)及耐多藥組(4.601 6±1.290 18；6.962 7±6.929 48)表達均上調且差異有統計學意義(P<0.01)，mazF3基因在單耐藥組及耐多藥組差異無統計學意義(P>0.05)，抗毒素基因mazE3在單耐藥(0.360 6±0.125 27)及耐多藥組(0.201 6±0.165 42)中表達均下調，差異有統計學意義(P<0.01)，mazE6均無統計學意義，mazE9只有在耐多藥組(0.398 9±0.376 79)中表達下調，差異有統計學意義，(P<0.01)。結論 毒素基因mazF6,9抗毒素基因mazE3,9可能參與了結核分枝桿菌的耐藥形成，具體機制尚待進一步的研究。

結核分枝桿菌；毒素-抗毒素系統；耐藥性；耐多藥

毒素-抗毒素系統(toxin-antitoxin systems, TAS)最早發現于低拷貝的質粒中，隨后的研究發現在某些細菌如結核分枝桿菌的染色體上也存在TA系統[1]。TA系統是由兩個相互重疊的基因組成的一個操縱子，其中一個編碼TA毒素蛋白，另一個編碼抗毒素[2-3]。毒素蛋白以不同的方式影響細胞功能，如DNA復制，蛋白質合成，細胞分裂，肽聚糖生物合成以及核糖體組裝等，其中RNA裂解是常見的方式[4-7]。根據抗毒素的作用方式及化學本質TA家族可分成5型[8]。mazEF是II型系統，其中mazE編碼不穩定的抗毒素MazE，mazF編碼穩定的毒素蛋白MazF，MazF為一種核糖核酸內切酶能切割單鏈mRNA，MazF切割mRNA具有ACA特異性[9-12]。毒素-抗毒素系統(TAS)能夠感應不同的環境條件如氨基酸缺乏，氧化應激，缺氧，被巨噬細胞吞噬及在宿主組織中[13-17]。

結核病(tuberculosis, TB)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病。隨著結核分枝桿菌耐藥率的增高，結核病的感染率及死亡率日益增高。結核分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(TAS)可能促進細菌適應環境變化，休眠及產生耐藥[18]。本實驗選擇用qRT-PCR的方法檢測mazEF系統中抗毒素基因mazE3,6,9及毒素基因mazF3,6,9在耐藥菌株中的表達，并與對照株H37Rv進行比較，同時觀察單耐藥及耐多藥菌株在不同培養條件下的生長情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 結核分枝桿菌標準株H37Rv及40株結核分枝桿菌臨床分離株(菌株為本實驗室人員從新疆開放性結核病患者痰液中分離并做藥敏鑒定，并由本實驗室保存)，其中單耐藥組20株，耐多藥組20株。

1.1.2 主要試劑與儀器 細菌RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，逆轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒及實時定量PCR儀購自Life Technologies公司。

1.2 方法1.2.1 引物設計及合成 將目的片段發給上海生物工程公司，由該公司設計實時定量引物(表1)并合成。

表1 引物序列
Tab.1 Primer sequences

引物名稱Primer引物序列Nucleotidesequence引物名稱Primer引物序列NucleotidesequenceSiga-F5'-CTGCAGCAAAGTGAAGGACA-3'MazF3-F5'-TATGACACCACCCAATCG-3'Siga-R5'-TCGAGGTGATCAACAAGCTG-3'MazF3-R5'-ACCTATCCACTACGCACAGC-3'MazE3-F5'-CCAGCGTATCCAGATCACC-3'MazF6-F5'-GGTCGGTGAGGTCAGTCTTG-3'MazE3-R5'-GCGGGTGCATACCAAACT-3'MazF6-R5'-GGTGATTAGTCGTGCCGAGAT-3'MazE6-F5'-TCACCACTCATCGTCCTG-3'MazF9-F5'-TCAAAGCCTCATCGAGCTG-3'MazE6-R5'-ATGAAGACAGCTATTTCTCTGCC-3'MazF9-R5'-GAGGTAGCGAAGCGAACAAC-3'MazE9-F5'-CATGCGTTGGCATAGTCATC-3'MazE9-R5'-TATGTGAAACGAGCGGGATT-3'

1.2.2 細菌總RNA提取及逆轉錄 取在7H9液體培養基(含OADC增菌劑)中生長至對數期的細菌1～3 mL，按Qiagen公司RNA提取試劑盒操作步驟提取RNA，1.2%變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。取5 μL的RNA加入2 μL oligo(dT)，2 μL super pure dntps，70 ℃加熱5 min后迅速在冰上冷卻，然后加入4 μL 5×First-strand buffer，0.5 μL Rnasin，1 μL lM-Mlv混勻，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min終止反應逆轉錄為cDNA，最后無酶水定容至20 μL，-20℃保存備用。以cDNA 為模板進行特異性擴增，反應條件(表2)。以結核分枝桿菌H37Rv標準株為模板擴增出mazE3 6 9 mazF3 6 9 長度分別為321 bp; 249 bp; 231 bp; 312 bp; 345 bp;357 bp(圖1)。

M:DNA marker;1 to 6 gene of mazE3,6,9 and mazF3,6,9 in turnM為DNA maker，1到6泳道分別為抗毒素基因mazE3,6,9和毒素基因mazF3,6,9圖1 基因mazE3 6 和mazF3 6 9 擴增片段。Fig.1 PCR amplification of mazE3,6,9 and mazF3,6,9 genes

表2 PCR反應條件
Tab.2 PCR Reaction conditions

基因Gene引物Primer反應條件Reactionconditions基因Gene引物Primer反應條件ReactionconditionsmazE3MazE3-R95℃5min;57℃15s;72℃1minmazF3MazF3-R95℃5min;57℃15s;72℃1minMazE3-FMazF3-FmazE6MazE6-R95℃5min;57℃15s;72℃1minmazF6MazF6-R95℃5min;57℃15s;72℃1minMazE6-FMazF6-FmazE9MazE9-R95℃5min;57℃15s;72℃1minmazF9MazF9-R95℃5min;57℃15s;72℃1minMazE9-FMazF9-F

1.2.3 qRT-PCR檢測mazE3,6,9 和mazF3,6,9mRNA的表達水平 以Siga為陽性對照，反應體系共20 μL LSYBR Select Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，無酶水7 μL ，50 ℃ 2 min激活SYBR，95 ℃預變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s ,72 ℃ 1 min 40個循環。實時定量PCR儀器自動繪制溶解曲線。

2 結 果

2.1 毒素基因mazF3,6,9在單耐藥、耐多藥株及標準株H37Rv中的表達(圖2)，結果顯示，mazF6,9基因在單耐藥及耐多藥菌組中的表達均高于標準株H37Rv,有統計學意義，而mazF3無論在單耐藥還是耐多藥組中的表達與標準株相比均無統計學意義。

注：**P<0.01Measuring toxin transcript levels by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). For RT-PCR analysis, mRNA was extracted from different groups, significant differences were observed for the different groups (**P<0.01).圖2 qPT-PCR檢測毒素基因mazF3,6,9在各組的表達量Fig.2 Measuring toxin genes transcription levels by quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

2.2 抗毒素基因mazE3,6,9在單耐藥，耐多藥及標準株H37Rv中的表達(圖3)，結果顯示抗毒素基因mazE3在單耐藥及耐多藥菌株中表達都低于標準株H37Rv，mazE9只有在耐多藥菌株中的表達才低表達，而mazE6的表達量與標準株H37Rv相比無統計學意義。

注：**P<0.01Measuring antitoxin transcript levels by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). For RT-PCR analysis, mRNA was extracted from different groups, significant differences were observed for the different groups (**P<0.01).圖3 qPT-PCR檢測抗毒素基因mazE3,6,9在各組的表達量Fig.3 Measuring antitoxin genes transcription levels by quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

2.3 結核分枝桿菌在不同培養條件下的生長情況

分別從單耐藥及耐多藥菌株中取出3株菌株及H37Rv共7株菌，在7H9液體培養基中37 ℃，搖床中培養7 d，調整濁度為0.06MCF后分別接種到7H9液體培養基，PBS(低營養)及缺氧的試管中，37 ℃搖床中培養，分別于培養的第2,4,6,8,10 d檢測濁度，然后進行統計學分析。

2.3.1 單耐藥菌株，耐多藥菌株及標準株H37Rv在7H9液體培養基中第2,4,6,8,10 d的生長濁度(圖4)，結果顯示，單耐藥組在培養的第2,4,6 d濁度不同但是無統計學意義(P>0.05)，第8,10 d有統計學差異(P<0.01),耐多藥組在培養第2,4 d濁度不同但是差異無統計學意義(P>0.05)，第6,8,10 d差異有統計學意義(P<0.01)。

注：*單耐藥菌株與H37Rv相比,#耐多藥菌株與H37Rv相比，**表示P<0.01*mono-resistance strains compared with H37Rv, #multidrug resistance strains compared with H37Rv, **P<0.01圖4 不同培養時間點結核分枝桿菌在7H9液體培養基中的生長濁度Fig.4 The counts of bacteria at different culture time points under the condition of 7H9 liquid culture

2.3.2 單耐藥菌株，耐多藥菌株及標準株H37Rv在PBS(低營養)培養基中第2,4,6,8,10 d的生長濁度(圖5)，結果顯示，單耐藥組及耐多藥組在培養的第2,4 d生長濁度不同但無統計學意義(P>0.05),在培養的第6,8,10 d濁度有差異，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：*單耐藥菌株與H37Rv相比, #耐多藥菌株與H37Rv相比，**表示P<0.01*mono-resistance strains compared with H37Rv, #multidrug resistance strains compared with H37Rv, **P<0.01圖5 不同培養時間點結核分枝桿菌在PBS液體培養基中的生長濁度Fig.5 The counts of bacteria at different culture time points under the condition of PBS liquid culture

2.3.3 單耐藥菌株，耐多藥菌株及標準株H37Rv在低氧條件下培養第2,4,6,8,10 d的生長濁度(圖6)，結果顯示單耐藥，耐多藥在培養的第2 d開始濁度就有差異，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：*單耐藥菌株與H37Rv相比,#耐多藥菌株與H37Rv相比，**表示P<0.01*mono-resistance strains compared with H37Rv, #multidrug resistance strains compared with H37Rv,**P<0.01圖6 不同培養時間點結核分枝桿菌在缺氧條件下的生長濁度Fig.6 The counts of bacteria at different culture time points under the condition of anoxia culture

3 討 論

我國是全球第二大結核病高負擔國家，也是全球27個耐多藥結核病嚴重的國家之一，耐藥結核病報告發病人數始終位居法定報告甲乙類傳染病前列。結核分枝桿菌耐藥機理尚不完全清楚，與許多機制有關[19]。

盡管毒素-抗毒素(TA)系統的功能尚未完全闡明，但是一些研究表明TA系統能夠對外界壓力產生應答[20,9]。在環境脅迫條件下不穩定的抗毒素降解，毒素發揮作用，介導細菌的耐藥，持留形成或死亡的發生[8]。在大量的結核分枝桿菌TA系統中，已有30個被證明具有一定的功能[20]，TA系統在該菌可能遭遇多種壓力如低氧[21]、營養缺乏[22]、被巨噬細胞吞噬[16]和抗生素毒性[14]等，可引起細菌生長抑制、持留狀態及耐藥，提高對抗生素及不良環境的適應能力，對于引起結核病的遷延及反復感染起著重要作用。現在研究最多的TA系統是mazEF家族。

本實驗選擇了單耐藥及耐多藥菌株作為研究對象，根據結果看毒素mazF3,6,9以及抗毒素mazE3,6,9表達并不相同，毒素基因MazF3 6在單耐藥及耐多藥組與H37RV相比均高表達，差異有統計學意義，而MazF9在兩實驗組中差異均無統計學意義。抗毒素mazE3在單耐藥及耐多藥組中都低表達，與對照株H37Rv相比差異有統計學意義，而mazE6無論在單耐藥還是耐多藥組中，差異都無統計學意義(圖1.2)，這是否與不同藥物的作用機制不同有關還不清楚，MazEF家族中的毒素抗毒素是否會相互作用，這都需要進一步的研究。不同條件下培養比濁結果表明無論是單耐藥組還是耐多藥組對于低氧和低營養的耐受都比對照株H37Rv好。在單耐藥及耐多藥菌株中mazF6,9都高表達，而mazF作為一種限制性內切酶切割單鏈ACA,毒素持續過表達也會導致細菌的死亡[10,23-24]。從不同條件培養的生長曲線來看，毒素高表達的耐藥株反而能更好的適應不利生存環境而沒有死亡，是否是因為毒素表達量沒有達到導致菌體死亡的濃度還需要進一步研究。如果毒素高表達在一定范圍內只是提高了菌體對不利環境的耐受性，只有更高的表達才能誘導菌體的死亡，那么我們是否可以找到這個臨界值誘導耐藥菌中的MazF表達達到殺菌的濃度？從mRNA到最終的功能蛋白，這其中還要經過翻譯，蛋白修飾等過程，這些因素都將影響蛋白質的功能，因此，聯合蛋白質水平進行研究結核菌的耐藥性也是十分必要的。

[1] Chang JN,Ning DG. Identification of a pair ofToxin-antitoxin(TA) gene in the chromosome of cyanobacteria synechocystis sp. PCC6803. Microbiology China, 2009, 36(1):31-36 (in Chinese)

常家寧, 寧德剛. 藍細菌PCC6803染色體上的一對毒素-抗毒素基因的鑒定[J]. 微生物學通報, 2009, 36(1)：31-36.

[2] Gerdes K, Christensen SK, Lubnerolesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci[J]. Nat Rev Microbiol, 2005, 3(5)：371-382.

[3] Yamaguchi Y, Inouye M. Regulation of growth and death inEscherichiacoliby toxin-antitoxin systems[J]. Nat Rev Microbiol, 2011, 9(11)：779-790.

[4] Winther KS, Gerdes K. Enteric virulence associated protein VapC inhibits translation by cleavage of initiator tRNA[J]. Proc Nat Acad Sci, 2011, 108(18)：7403-7407.

[5] Mutschler H, Gebhardt M, Shoeman R L, et al. A novel mechanism of programmed cell death in bacteria by Toxin-antitoxin systems corrupts peptidoglycan synthesis[J]. PLoS Biol, 2011, 9(3)：e1001033-e1001033.

[6] Tan Q, Awano N, Inouye M. YeeV is anEscherichiacoliToxin that Inhibits Cell Division by Targeting the Cytoskeleton Proteins, FtsZ and MreB[J]. Mol Microbiol, 2011, 79(1)：109-118.

[7] Prysak M H, Mozdzierz C J, Cook A M, et al. Bacterial toxin YafQ is an endoribonuclease that associates with the ribosome and blocks translation elongation through sequence-specific and frame-dependent mRNA cleavage[J]. Mol Microbiol, 2009, 71(5)：1071-1087.

[8] Schuster C F, RalphBertram. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate[J]. FEMS Microbiol Lett, 2013, 340(2)：73-85.

[9] Aizenman E, Engelbergkulka H, Glaser G. AnEscherichiacolichromosomal "addiction module" regulated by guanosine [corrected] 3′,5′-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death[J]. Proc Nat Acad Sci, 1996, 93(12)：6059-6063.

[10] Zhang Y, Zhang J, Hoeflich KP, et al. MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis inEscherichiacoli[J]. Mol Cell, 2003, 12(4)：913-923.

[11] Suzuki M, Mao L, Inouye M. Single protein production (SPP) system inEscherichiacoli[J]. Nat Protoc, 2007, 2(7)：1802-1810.

[12] Suzuki M, Zhang J, Liu M, et al. Single protein production in living cells facilitated by an mRNA interferase[J]. Mol Cell, 2005, 18(2)：253-261.

[13] Ramage HR, Connolly LE, Cox JS. Comprehensive functional analysis ofMycobacteriumtuberculosistoxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis, stress responses, and evolution[J]. PLoS Genet, 2009, 5(12)：1000767.

[14] Singh R, Barry CE, Boshoff HI. The three RelE homologs ofMycobacteriumtuberculosishave individual, drug-specific effects on bacterial antibiotic tolerance[J]. J Bacteriol, 2010, 192(5)：1279-1291.

[15] Keren I, Minami S, Rubin E, et al. Characterization and transcriptome analysis ofMycobacteriumtuberculosispersisters.[J]. Mbio, 2011, 2(3)：00100-00111.

[16] Korch SB, Contreras HClark-Curtiss JE. ThreeMycobacteriumtuberculosisRel toxin-antitoxin modules inhibit mycobacterial growth and are expressed in infected human macrophages[J]. J Bacteriol, 2009, 191(5)：1618-1630.

[17] Ramirez MV, Dawson CC, Crew R, et al. MazF6 toxin ofMycobacteriumtuberculosis, demonstrates antitoxin specificity and is coupled to regulation of cell growth by a Soj-like protein[J]. BMC Microbiol, 2013, 13(1)：986-991.

[18] Han JS, Lee JJ, Anandan T, et al. Characterization of a chromosomal toxin-antitoxin, Rv1102c-Rv1103c system inMycobacteriumtuberculosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 400(3)：293-298.

[19] Xu Y, Zhang Z, Sun Z. Drug resistance toMycobacteriumtuberculosis: from the traditional Chinese view to modern systems biology[J]. Crit Rev Mycrobio, 2015，41(3)：399-410.

[20] Buts L, Lah J, Dao-Thi MH, et al. Toxin-antitoxin modules as bacterial metabolic stress managers[J]. Trends Biochem Sci, 2005, 30(12)：672-679.

[21] Rustad TR, Harrell MI, Liao R, et al. The enduring hypoxic response ofMycobacteriumtuberculosis[J]. PloS One, 2008, 3(1) e1502.

[22] Albrethsen J, Agner J, Piersma SR, et al. Proteomic profiling ofMycobacteriumtuberculosisidentifies nutrient-starvation-responsive toxin-antitoxin systems [J]. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(5)：1180-1191.

[23] Zhang Y, Zhang J, Hara H, et al. Insights into the mRNA cleavage mechanism by MazF, an mRNA interferase[J]. J Biol Chem, 2005, 280(5)：3143-3150.

[24] Erental A, Sharon I, Engelbergkulka H. Two programmed cell death systems in,Escherichiacoli: an apoptotic-Like death is inhibited by the mazEF-mediated death pathway[J]. PLoS Biol, 2012, 10(3)：490-493.

Detection on expression levels of mazE F toxin-antitoxin system inMycobacteriumtuberculosisby qRT-PCR

LIU Wei，ZHAO Ji-li，QU Yan-lin，XIE Wan-ying，YUAN Li

(DepartmentofImmunology,SchoolofMedicineSheheziUniversity,Shehezi832000,China)

We investigate the different expression of toxin genemazF3,6,9 and antitoxin genemazE3,6,9 in the drug-resistanceMycobacteriumtuberculosis,we used quantitative real-time polymerase chin reaction method to detect the expression level of toxin genemazF3,6,9 and antitoxin genemazE3,6,9 inM.tuberculosis(20 mono-resistance strains, 20 multidrug resistance strains and standard strain H37Rv).The differences of gene expression levels between groups were analyzed by one-way ANOVA. Contrasting with control group, toxin genesmazF6,9 were up-regulated expression levels both in mono-resistance (11.1519±22.31721；8.4306±17.97897) and multidrug resistance (4.6016±1.29018；6.9627±6.92948), had statistical significance (P<0.01),mazF3 expression levels had statistical significance neither in mono-resistance nor in multidrug resistance (P>0.05); antitoxin genesmazE3 was in down-expression level, and had statistical significance both in mono-resistance (0.3606±0.12527) and multidrug resistance (0.2016±0.16542) (P<0.01),mazE6 had no statistical significance (P>0.05)either in mono-resistance or multi drug resistance,mazE9 only in multidrug resistance(0.3989±0.37679) was in down-expression level, and has statistical significance (P<0.001). The toxin genemazF6,9 and antitoxin genemazE3,9 may participate in the drug-resistance formation ofM.tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; toxin-antitoxin system; drug resistance; multidrug resistance

Yuan Li,Email:yuanli832000@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.010

國家自然科學基金(No.81341079，81560264)資助

袁 俐, yuanli832000@sina.com

石河子大學醫學院,免疫學教研室，石河子 832000

R378

A

1002-2694(2017)02-0143-05

2016-09-26 編輯：王曉歡

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No:81341079 and 81560264)