γ-干擾素及外源性吲哚對泌尿生殖道沙眼衣原體生長影響的探討

劉志超，劉原君，劉建剛，劉全忠

γ-干擾素及外源性吲哚對泌尿生殖道沙眼衣原體生長影響的探討

劉志超1，劉原君2，劉建剛1，劉全忠2

目的 探討外源性吲哚及γ-干擾素對國內沙眼衣原體優勢株E-UW-5/Cx型標準株及臨床株生長的影響，并與國外優勢株D-UW-5/Cx進行比較。方法 分別用DMEM-10、DMEM-10加5 ng/mL 重組人γ-干擾素和 DMEM-10加5 ng/mL 重組人γ-干擾素及50 μmol外源性吲哚三種細胞培養液培養沙眼衣原體至48 h，甲醇固定后計數包涵體，觀察γ-干擾素及外源性吲哚對E型、D型沙眼衣原體標準株及臨床株生長的影響。結果 DMEM-10+IFN組衣原體包涵體計數明顯低于DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組，差異有統計學意義，P<0.05；DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組包涵體計數差異無統計學意義；E型標準株、臨床株與D型標準株、臨床株之間差異無統計學意義，P>0.05。結論 在IFN-γ作用下，沙眼衣原體的生長繁殖受到明顯抑制，加入外源性吲哚后, 泌尿生殖道沙眼衣原體可以逃逸IFN-γ介導的清除作用，恢復其感染活力。

沙眼衣原體； Hela細胞；γ-干擾素；外源性吲哚

泌尿生殖道沙眼衣原體感染(genital chlamydial infections，GCI)是目前世界范圍內最為流行的性傳播疾病，已經成為較嚴重的公共衛生問題，其臨床表現復雜，遷延難愈，大約10%～15%的患者在治療期間出現再感染和持續感染[1]。衣原體持續感染[2]是指衣原體在不利生長的條件下，逃逸宿主的免疫防御而產生的一種可逆狀態，但并不是所有感染衣原體的患者都會出現持續感染，臨床發現在相同環境下，女性中更容易造成Ct的慢性炎癥并導致更為嚴重的后果。這就提示女性生理結構及激素水平在疾病發展中起著一定的作用。為了進一步探討沙眼衣原體持續感染形成的機制，我們在既往研究的基礎上，探討γ-干擾素及外源性吲哚對國內沙眼衣原體優勢株E-UW-5/Cx型標準株及臨床株生長的影響，以期發現沙眼衣原體持續感染的可能機制，為臨床提供診療幫助。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 沙眼衣原體菌株 沙眼衣原體E-UW-5/Cx型、D-UW-5/Cx標準株由美國馬里蘭大學衣原體研究中心提供，臨床株由天津醫科大學性傳播疾病研究所提供并保存。

1.1.2 Hela細胞(人宮頸癌細胞起源) 購自中國醫學科學院皮膚病研究所，并由天津市性傳播疾病研究所細胞培養室保存。

1.1.3 DMEM-10細胞培養液 DMEM粉9.6 g、NaHCO32 g加蒸餾水至1 000 mL，用直徑為0.2 μm的濾器抽濾DMEM液，分裝至無菌瓶中，并用封口膜密封。

1.1.4 吲哚 0.023 43 g吲哚溶于200 mL甲醇，形成10 000 μmol/L indole；按倍數稀釋，形成50 μmol/L indole。

1.1.5 5 ng/mL 人重組IFN-γ制備：100萬U人重組IFN-γ(含60 ng IFN-γ)用PBS緩沖液溶解至12 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 用DMEM-10細胞培養液培養Hela細胞48 h。

1.2.2 將生長狀態良好的Hela細胞傳至6孔板，繼續培養24 h，形成致密單層。

1.2.3 將感染率為3-5MOI[13]的沙眼衣原體E型、D型標準株及其臨床株分別接種至不同的6孔板[4]。

1.2.4 32 ℃，3 000 r/min,離心1 h，5%CO237 ℃孵箱靜置2 h后，分別用DMEM-10、DMEM-10加5 ng/mL 重組人γ-干擾素(簡稱DMEM-10+IFN)和 DMEM-10加5 ng/mL 重組人γ-干擾素及50 μmol外源性吲哚(簡稱DMEM-10+IFN+IND)3種細胞培養液培養沙眼衣原體菌株。

1.2.5 繼續培養48 h后，分別收集上清液，并用冰雙蒸水溶解細胞，收集上述全部混合液，再接種至新的Hela細胞6孔板，按上述方法繼續培養48 h。

1.2.6 包涵體計數方法 細胞培養48 h后，棄去培養板中液體，風干后甲醇固定15 min，用盧戈氏碘液染色，計數不同培養液作用下的包涵體數目，每孔計數30個視野(×400倍鏡下)取均值。臨床株采用相同的計數方法。

1.3 統計學方法 采用SPSS18軟件進行分析，各組數值間采用q檢驗，P<0.05，差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3種不同培養液作用下沙眼衣原體E-UW-5/Cx臨床株的包涵體數目及細胞形態。從圖1可見，與正常細胞相比，外源性干擾素及吲哚干預后的細胞形態正常，狀態良好；圖1a、圖1c的包涵體數目明顯多于圖1b。

2.2 DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND對沙眼衣原體E型標準株和臨床株生長的影響。DMEM-10+IFN組衣原體包涵體計數明顯低于DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組，差異有統計學意義，P<0.05；DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組包涵體計數差異無統計學意義P>0.05,見表1。

2.3 DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND對沙眼衣原體D型標準株和臨床株生長的影響。DMEM-10+IFN組衣原體包涵體計數明顯低于DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組，差異有統計學意義，P<0.01；DMEM-10組和DMEM-10+IFN+IND組包涵體計數差異無統計學意義P>0.05；E型標準株、臨床株與D型標準株、臨床株之間差異無統計學意義，P>0.05，見表2、表3。

a b c注：圖中褐色深染的即為沙眼衣原體的包涵體。圖1a為DMEM-10組(正常)的包涵體；圖1b、圖1c分別為DMEM-10+IFN組及DMEM-10+IFN+IND組的包涵體。Note:The brown stains in the picture are the inclusion body of C. trachomatis. Figure 1a is the inclusion body of DMEM-10 (normal). Figure 1b and figure 1C is the inclusion bodies of group DMEM-10+IFN and group DMEM-10+IFN+IND respectively.圖1 不同培養液作用下的包涵體數目(× 400)Fig.1 The number of inclusion bodies in different culture media (× 400)

表1 γ-干擾素及外源性吲哚對E型標準株及臨床株生長的影響
Tab.1 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type E standard and clinical strains

組別groups全孔包涵體的平均數量theaveragenumberofinclusionsinthewholeporeE型標準株typeEstandardstrainsQPE型臨床株typeEclinicalstrainsQPDMEM-1081.97±7.64▲45.3536<0.0566.97±3.84▲60.8905<0.05DMEM-10+IFN28.33±5.04▽1.1668>0.0525.87±3.24▽2.1334>0.05DMEM-10+IFN+Ind83.35±6.49▲46.5205<0.0568.41±3.97▲63.0239<0.01

注：3組包涵體均數兩兩比較，進行q檢驗，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

表2 γ-干擾素及外源性吲哚對D型標準株及臨床株生長的影響
Tab. 2 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type D standard and clinical strains

組別groups全孔包涵體的平均數量theaveragenumberofinclusionsinthewholeporeD型標準株typeDstandardstrainsQ值QP值PD型臨床株typeDclinicalstrainsQ值QP值PDMEM-1065.87±7.20▲29.3624<0.0564.57±5.12▲43.2044<0.05DMEM-10+IFN25.62±6.17▽2.3052>0.0523.91±5.03▽1.7639>0.05DMEM-10+IFN+Ind69.03±8.90▲31.6676<0.0166.23±5.31▲44.9683<0.05

注：3組包涵體均數兩兩比較，進行q檢驗，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

表3 γ-干擾素及外源性吲哚對E型、D型標準株及臨床株衣原體生長的影響
Tab.3 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type D、E standard and clinical strains

組別groups全孔包涵體的平均數量TheaveragenumberofinclusionsinthewholeporeE型標準株typeEstandardstrainsE型臨床株typeEclinicalstrainsD型標準株typeDstandardstrainsD型臨床株typeDclinicalstrainsDMEM-1081.97±7.64▲66.97±3.84▲65.87±7.20▲64.57±5.12▲DMEM-10+IFN28.33±5.04▽25.87±3.24▽25.62±6.17▽23.91±5.03▽DMEM-10+IFN+Ind83.35±6.49▲68.41±3.97▲69.03±8.90▲66.23±5.31▲

注：3組包涵體均數兩兩比較，進行q檢驗，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

3 討 論

沙眼衣原體是一種專性細胞內寄生性病原體，進入機體后能誘發機體產生細胞免疫應答和體液免疫應答，其中以CD4+Thl細胞介導的細胞免疫應答占優勢，可增強宿主對微生物感染尤其是細胞內病原體的免疫性和防御功能，特別是Thl細胞分泌的γ 干擾素在疾病的發生、發展中起關鍵作用[3-6]。

沙眼衣原體為色氨酸營養缺陷體，其生長繁殖需從宿主細胞中獲得色氨酸。本研究通過模擬體內環境γ-干擾素及吲哚濃度[7]，分別用DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND三種細胞培養液培養國內沙眼衣原體優勢株E-UW-5/Cx型標準株及臨床株，并與國外優勢株D-UW-5/Cx進行比較，統計后發現DMEM-10+IFN組衣原體包涵體計數明顯低于DMEM-10組，差異有統計學意義，說明加入濃度為5 ng/mL 人重組IFN-γ后，沙眼衣原體的生長繁殖明顯受到抑制，其可能機制是IFN-γ誘導人宿主細胞產生吲哚胺2,3二氧化酶(IDO)，降解內源性色氨酸，剝奪沙眼衣原體復制所需的營養，從而抑制衣原體的生長，因而持續暴露于IFN-γ中有可能消除Ct感染[8-9]。而DMEM-10+IFN+IND組包涵體數目則與DMEM-10組差異無統計學意義，說明IFN-γ誘導人宿主細胞產生IDO，降解內源性色氨酸，抑制沙眼衣原體生長，使網狀體(RB)發生變異，發展成無感染性的非典型形態的RB，而補充外源性色氨酸(吲哚)后，非典型形態的RB又能恢復原生長活性，繼續以二分裂方式進行分裂、繁殖，釋放具有感染性的原體(EB)，導致持續感染[10]，未影響其生長繁殖活性。

有研究證明，在給予IFN-γ時，如果增加外源性吲哚會使其恢復到衣原體的正常發育周期，這種拯救性行為只發生在Ct的生殖器菌株中，這可能與Ct生殖器菌株的亞型擁有某些功能性色氨酸合成酶的基因[11]有關，該基因可使泌尿生殖道菌群分泌的吲哚轉變成色氨酸，使衣原體逃脫IFN-γ的殺傷作用，形成持續感染。在女性尿道中存在多種可以產生吲哚的微生物, 包括梭菌屬、消化鏈球菌屬、革蘭陰性需氧菌(大腸桿菌) 等, 而男性尿道中吲哚產生相對較少，因此女性更容易造成Ct的慢性炎癥并導致更為嚴重的后果。

本研究結果顯示泌尿生殖道沙眼衣原體天津地區優勢株E型標準株、臨床株在給予IFN-γ時，其包涵體數目比正常組(無干擾素組)明顯減少；在加入外源性吲哚后，衣原體生長又有明顯的恢復，包涵體數目與正常組差異無統計學意義。說明當外源性吲哚存在時, 泌尿生殖道沙眼衣原體可以逃逸IFN-γ介導的清除作用，利用吲哚作為底物來合成生長所必需色氨酸，從而可以快速的分裂、繁殖，從網狀體轉變為有感染性的原體。這與Caldwell 等[7]研究： 在0.1 ～1.0 μmol低濃度吲哚存在時,Ct就可以逃逸IFN-γ介導的清除作用并產生有感染性的原體, 維持致病能力相一致。

[1] Wang SA,Papp JR,Stamm WE,et al. Evaluation of antimicrobial resistance and treatment failures forChlamydiatrachomatis:a meeting report[J]. Infect Dis,2005,191(6): 917-923.DOI:10.1086/428290.

[2] Jing Y,Liu QZ. Advances inChlamydiatrachomatispersistent infection[J]. Int J of Dermatol Venereo,2007,32(2):119-121.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2007.02.017(in Chinese)

江勇,劉全忠.沙眼衣原體持續感染的進展[J].國際皮膚性病學雜志.2007,33(2)：119-121.

[3] Al-Zeer MA, Al-Younes HM, Lauster D, et al. Autophagy restrictsChlamydiatrachomatisgrowth in human macrophages via IFNG-inducible guanylate binding proteins[J]. Autophagy, 2013, 9(1): 50-62. DOI:10.4161/auto.22482.

[4] Matsuzawa T, Fujiwara E, Washi Y. Autophagy activation by interferon-γ via the p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway is involved in macrophage bactericidal activity[J]. Immunology, 2014, 141(1): 61-69. DOI :10.1111/imm.12168.

[5] Roan NR,Starnbach MN.Immune-mediated control ofChla-mydiainfection[J]. Cell Microbiol, 2008, 10(1): 9-19.DOI:10.1111/i.1462-5822.2007.01069.x.

[6] Schautteet K, De Clercq E, Vanrompay D.Chlamydiatrachomatisvaccine research through the years[J]. Infect Dis Obstet Gynecol, 2011, 2011: 963513.DOI:10.1155/2011/963513.

[7] Caldwell HD, Wood H, Crane D, et al. Polymorphisms inChlamydiatrachomatistryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates[J]. J Clin Invest, 2003, 111(11): 757-769. DOI:10.1172/JCI17993.

[8] Al-Zeer MA, Al-Younes HM, Braun PR, et al. IFN-γ-inducible Irga6 mediates host resistance againstChlamydiatrachomatisvia autophagy[J].PLoS One,2009.4(2):e4588. DOI:10.1371/journal.pone.0004588

[9] Burian K, Endresz V, Deak J, et al. Transcriptome analysis indicates an enhanced activation of adaptive and innate immunity byChlamydia-infected murine epithelial cells treated with interferong[J]. J Infect Dis, 2010, 202(9): 1405-1414. DOI:10.1086/656526.

[10] Ying HX, Meng YL.Ctinfection and cytokine[J]. Foreign Med Sci,2004,15(3):169-172. DOI:10.3969/j.issn.1673-5293.2004.03.016(in Chinese)

尹虹祥,孟運蓮.沙眼衣原體感染與細胞因子[J]. 國外醫學婦幼保健分冊,2004,15(3): 169-172.

[11] Sakaguchi S, Wing K, Onishi Y, et al. Regulatory T cells: how do they suppress immune responses？[J]. IntImmunol,2009,21(10): 1105-1111. DOI:10.1093/intimm/dxp095

Effect of interferon-γ and exogenous indole on the growth ofChlamydiatrachomatis

LIU Zhi-chao1, LIU Yuan-jun2，LIU Jian-gang1，LIU Quan-zhong2

(1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospital,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;2.DepartmentofDermatology,GeneralHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China)

We investigated the effects of γ-interferon and exogenous indole on the growth of domestic dominant standard strains and clinical strains ofChlamydiatrachomatisE-UW-5/Cx, and compared with the dominant strains of D-UW-5/Cx abroad. We used DMEM-10, DMEM-10 containing 5 ng/mL recombinant human interferon gamma (referred to as DMEM-10+IFN) and DMEM-10 containing 5 ng/mL recombinant human interferon gamma and 50 μM exogenous indole (referred to as DMEM-10+IFN+IND) to cultureC.trachomatis, and then we fixed it with methanol to count inclusions after 48 hours, observing the influence of r-interferon and exogenous indole on the growth ofC.trachomatisstandard strains(E, D) and clinical strains. Results showed that the count ofChlamydiainclusion bodies in DMEM-10+IFN group was significantly lower than others (P<0.05); no significant difference was found (P>0.05) between the count of DMEM-10 group between DMEM-10+IFN+IND group. There were no significant difference between the E and D standard or clinical strains (P>0.05). Under the effect of IFN-γ, the growth of domestic dominant strain E-UW-5/CxC.trachomatiswas significantly inhibited. After adding exogenous indole,C.trachomatiscan escape the scavenging activity of IFN-γ to restore the infection vitality.

Chlamydiatrachomatis; Hela cell; interferon-γ; exogenous indole

Liu Quan-zhong, Email: liuquanzhong@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.008

山東省自然科學基金項目(No.ZR2011HL009)和泰安市科技發展計劃項目(No.2016NS1167)聯合資助

劉全忠，Email:liuquanzhong@medmail.com.cn

1.泰山醫學院附屬醫院，泰安 271000； 2.天津醫科大學總醫院，天津 300052

R374

A

1002-2694(2017)02-0131-05

2016-09-26 編輯：梁小潔

Supported by the Shandong Provincial Natural Science Foundation, China(No.ZR2011HL009)and the Tai'an Science and Technology Development Program(No.2016NS1167)