猬裂頭蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表達及生物信息學分析

焦夢涵，劉艷丹，陳 艷，李金福

猬裂頭蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表達及生物信息學分析

焦夢涵，劉艷丹，陳 艷，李金福

目的 克隆、表達猬裂頭蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease ，CP)基因，并分析其生物學特性。方法 提取蛇源猬裂頭蚴總RNA，逆轉錄合成cDNA，PCR擴增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因，克隆入pMD-19T載體，測序正確后將27kDa-CP基因亞克隆入表達載體pET-28a(+)，構建pET-28a(+)-27kDa-CP重組質粒，轉入大腸埃希菌Transetta(DE3)中，經IPTG誘導，表達目的蛋白27kDa CP。用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白。表達產物用SDS-PAGE及Western Blotting進行分析，并運用NCBI和ExPASy等有關的生物信息學分析工具，對27 CP基因及其編碼蛋白進行預測和分析。結果 CP基因序列的開放閱讀框長為1 011 bp，去除信號肽序列長954 bp，登錄到GenBank，獲得登錄號ANA52569。該基因編碼一個含317個氨基酸的蛋白多肽，屬于Peptidase_C39_like超家族，理論分子量約35 669.9 Da，等電點5.92。pET-28a(+)-27kDa-CP重組質粒經IPTG誘導后，蛋白在大腸埃希菌中成功表達，經純化后的蛋白利用Western blotting 檢測，證明與預期大小相符，且與猬裂頭蚴感染陽性血清有較好的結合反應。結論 成功克隆、表達了猬裂頭蚴27kDa CP基因，獲知CP基因及其編碼的氨基酸序列和生物信息學。

猬迭宮絳蟲；裂頭蚴；半胱氨酸蛋白酶基因；原核表達；生物信息學

猬裂頭蚴病(plerocercoidosis)是猬迭宮絳蟲中絳期裂頭蚴寄生人體引起，是重要的食源性寄生蟲病。全球約有1 400例病例的報道，而我國病例的報道已有千余例，包括27個省(區、市)[1]。不僅影響人、獸健康，而且蛙、蛇、豬等經濟飼養動物的培育、飼養及產量均會受到制約，因而受到人們的高度重視[2]。

半胱氨酸蛋白酶是寄生蟲的主要“消化酶”，對寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的研究主要涉及該酶參與蟲體營養吸收、入侵組織細胞、免疫逃避、生長發育及生殖等方面[3-12]。研究發現，裂頭蚴有3種分子量(53 kDa、21 kDa和27 kDa)的半胱氨酸蛋白酶，其中最重要的參與蟲體入侵及營養吸收的是27 kDa半胱氨酸蛋白酶[13-15]。

Kong Y[16]等對猬迭宮絳蟲27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因在蟲體不同發育階段的差異表達進行了研究，結果顯示，該酶基因在鉤球蚴和裂頭蚴中有表達，而在未成熟卵和成蟲中不表達，推測27 kDa半胱氨酸蛋白酶與蟲體的生長及移行有關。

目前，有關猬迭宮絳蟲半胱氨酸蛋白酶的研究鮮見報到，克隆、表達27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因，分析其生物學特性，再將其亞克隆入原核表達載體pET-28a(+)，并誘導表達重組蛋白，為進一步討論其功能和免疫篩選蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裂頭蚴 裂頭蚴檢獲于貴州安順地區野生王錦蛇，通過形態學及分子生物學鑒定為猬迭宮絳蟲裂頭蚴。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠10只，20～25 g，雄性，購自貴陽醫學院實驗動物中心，清潔級，合格證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.1.3 質粒和菌株 pET-28a(+)購置于大連寶生物工程有限公司；pMD-19T克隆載體，購置于大連TaKaRa公司；E.coliDH5α，由貴州醫科大學病原生物學實驗室常規保存；Transetta(DE3) Chemically Competent Cell，購置于上海生物技術有限公司。

1.1.4 主要試劑 RNAiso Reagent (Total RNA提取試劑)、逆轉錄試劑盒、DNA分子量標準DL2000、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA快速提取試劑盒、抗His標簽抗體、羊抗兔IgG/HRP、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自寶生物大連TaKaRa公司；羊抗小鼠HRP-IgG購自北京中衫金橋生物技術有限公司；Ni-IDA Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(cat No:69670)為美國Novagen公司產品；其他試劑為國內分析純。

1.2 方法

1.2.1 猬裂頭蚴總RNA提取及cDNA合成 總RNA的抽提按照TAKARA公司RNAiso PLUS的說明書進行操作。總RNA經電泳檢測，測定A260/280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2 引物的設計及基因擴增 根據NCBI中公布的猬裂頭蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因(D63670)序列，運用Premier 5.0 和DNAClub軟件設計引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物如下：SEP-CP-F: 5′-CCGGAATTCTCGACTGAAAGTGA-3，帶EcoRI酶切位點(下畫線處)；SEP-CP-R:5′-CGGAAGCTTTTACACGGTTGGAT-3′，帶HindⅢ酶切位點(下畫線處)。以貴州蛇源的猬裂頭蚴總RNA逆轉錄合成的cDNA 為模板，進行目的基因擴增。

PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、 59 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s,35個循環，72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,凝膠回收試劑盒回收DNA。

1.2.3 構建重組質粒pMD-19T-27kDa-CP 回收27kDa-CP基因的PCR產物，克隆入pMD-19T載體，連接轉化E.coliDH5α感受態菌，篩選陽性菌落。將PCR鑒定陽性的菌液按照質粒抽提試劑盒抽提，提取的重組質粒送上海生工生物技術有限公司測序。所得序列與NCBI D63670序列進行BLAST比對，確定其同源性。

1.2.4 構建表達載體pET-28a(+)-27kDa-CP 將測序正確的pMD-19T-27kDa-CP質粒和pET-28a(+)表達載體用限制性內切酶EcoRI和HindⅢ進行雙酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接產物轉入E.coliDH5α感受態菌中，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落，PCR和雙酶切鑒定后，送上海生工生物技術有限公司測序，測序正確的重組子命名為pET-28a(+)-27kDa-CP。

1.2.5 目的蛋白的誘導表達 挑取重組菌接種于5 mL LB液體培養基(卡那霉素,終濃度100 μg/mL)中，于37 ℃，200 r/min 振蕩培養至OD600=0.6，加入IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)進行誘導，在37 ℃、200 r/min條件下搖振誘導表達5 h。將上述處理的1 000 mL菌液于4 ℃，12 000 r/min，離心2 min，收集菌體，棄去上清。裂解緩沖液重懸菌體(4 mL/g濕菌)，反復凍融3次后，超聲裂解，4 ℃ 13 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀。用SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達情況。

1.2.6 目的蛋白的純化透析 沉淀經含2 mol/L和4 mol/L尿素的洗滌緩沖液反復洗滌后，按1 mL 加入1.5 mL含8 mol/L尿素的平衡洗滌緩沖液，重懸，3 h或冰浴過夜，4 ℃，16 000 r/min，離心30 min，收集上清。按Ni-IDA Agarose 純化試劑盒純化，用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白。收集鎳柱純化后的洗脫液，在PBS緩沖液中4 ℃透析20以上，其間更換4～5次透析液，用12%SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達情況。

1.2.7 感染小鼠血清制備 用檢獲的猬裂頭蚴經口感染小鼠10只，每只感染裂頭蚴5條，于感染2周后眼球取血，血置于離心管中室溫下放置2 h，再置4℃冰箱過夜，待血液凝固收縮后，4 000×g離心10 min，即獲感染小鼠血清，-20 ℃保存備用。

1.2.8 重組蛋白的Western blotting分析 一抗采用兔來源的抗His 標簽的單抗(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體(1∶2 000)。將重組蛋白27kDa-CP經12%SDS-PAGE后，轉移到PVDF膜，進行Western blotting 分析。一抗為猬裂頭蚴感染小鼠血清(1∶100)，二抗為羊抗小鼠HRP-IgG(1∶2 000)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后單蒸水終止反應。

1.2.9 生物信息學分析 利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(Expert Protein Analysis System, ExPASy, http://ca.expasy.org/)提供的生物信息學工具分析猬迭宮絳蟲裂頭蚴CP基因的特點；運用NCBI Blast對cNDA序列進行同源比對，用ProtParam分析蛋白等電點、分子質量；ProtScale分析蛋白質的疏水性；利用EMBL-EBI的在線分析工具InterProScan分析蛋白保守結構域以及活性位點。

2 結 果

2.1 目的基因的PCR擴增 擴增獲得的27kDa-CP基因長約1 000 bp，與預期大小基本相符,見圖1。

M：DNA標志物(DL2000)；1：27kDa-CP PCR 產物M: DNA marker(DL2000); 1: PCR product of 27kDa-CP 圖1 猬迭宮絳蟲裂頭蚴27kDa-CP基因的PCR產物Fig.1 PCR product of 27 kDa-CP gene of Spirometra erinacei pleroceroid

2.2 重組質粒的PCR和酶切鑒定 pET-28a(+)27kDa-CP重組質粒的PCR產物，以及酶切產物經鑒定，條帶與理論值完全吻合(見圖2)。重組質粒測序顯示，相應的插入序列與目的基因cDNA序列一致，有3個位點突變，即96、277、296位氨基酸，表明重組質粒構建成功。將測序后的序列登陸到GenBank，獲得的登錄號ANA52569。

M：DNA標志物(DL2000)；1：27kDa-CP PCR 產物；2：27kDa-CP PCR 產物(去信號肽)；3：pET-28a(+)；4：pET-28a(+)-27kDa-CP PCR 產物；5：pET-28a(+)-27kDa-CP單酶切；6：pET-28a(+)-27kDa-CP雙酶切(EcoRI和HindⅢ)M: DNA marker (DL2000); 1: PCR Product of 27kDa-CP; 2: PCR Product of 27kDa-CP (no signal peptide); 3: pET-28a(+); 4: PCR product of recombinant pET-28a(+)-27kDa-CP; 5: pET-28a(+)-27kDa-CP digested by single enzyme; 6: pET-28a(+)-27kDa-CP digested by EcoRI and HindⅢ圖2 重組質粒pET-28a(+)27kDa-CP的PCR和酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-28a(+)27kDa-CP by PCR and digestion with restriction enzymes

2.3 重組蛋白的誘導表達 重組菌經IPTG誘導，在相對分子質量(Mr)約35 kDa處出現一明顯的蛋白條帶，而重組菌在誘導前，空載菌在誘導前、后均未出現該蛋白條帶。蛋白既有可溶性表達，也有包涵體表達，主要是包涵體表達(見圖3)。將洗脫液透析后濃縮，測得純化產物的蛋白濃度為0.065 mg/mL。

M：蛋白質標志物；1：pET-28a(+)未誘導；2：pET-28a(+)誘導；3： pET-28a(+)-27kDa-CP未誘導；4： pET-28a(+)-27kDa-CP誘導；5：pET-28a(+)-27kDa-CP誘導后上清；6：pET-28a(+)-27kDa-CP誘導后沉淀；7：純化后的重組蛋白(箭頭)M：Protein marker; 1：pET-28a(+) without IPTG induction; 2：pET-28a(+) with IPTG induction; 3：pET-28a(+)-27kDa-CP without IPTG induction; 4：pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction;5：Supernatant of pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction; 6：Precipitation of pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction; 7：Purification recombinant protein(arrow)圖3 重組蛋白27kDa-CP的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein 27 kDa-CP

2.4 純化蛋白的Western blotting分析 Western blotting結果顯示，重組菌誘導后在Mr約為35 kDa處有被組氨酸(His)單克隆抗體識別的條帶。重組蛋白可被猬裂頭蚴感染的小鼠血清識別，在Mr35 kDa處出現特異條帶(圖4)。

M：蛋白質標志物；1、2、3：猬裂頭蚴鼠抗血清M：Protein marker；1、2、3：Mouse antiserum of Spirometra erinacei plerocercoid圖4 重組蛋白27kDa-CP 的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of recombinant protein 27 kDa-CP

2.5 生物信息學分析

2.5.1 基本理化性質 用DNAMAN分析軟件對猬裂頭蚴27 kDa CP的去信號肽編碼cDNA序列進行分析，該序列長度為954 bp，編碼317個氨基酸，理論分子量約為35 669.9 Da，等電點約為5.92，屬于酸性蛋白。蛋白不穩定指數為33.64，低于域值40，說明該蛋白質在溶液中性質穩定。疏水數為71.07，總親水性-0.454，蛋白質總體疏水性較高。

2.5.2 27 kDa CP的編碼cDNA序列的TA克隆及測序序列比對分析 將所得PCR產物純化后進行TA克隆，挑選陽性單克隆測序。運用NCBI Blast對測序后的cDNA序列與NCBI(D63670)序列進行BLAST比對，結果顯示同源性為99%，有13個堿基突變，與目的基因序列基本一致。

2.5.3 BLAST分析 通過NCBI的Blastn在線分析工具比對分析，結果顯示27 kDa CP的編碼cDNA屬于Peptidase_C39_like超家族,見圖5。

2.5.4 結構域預測 利用ExPASy中InterProScan在線分析預測，27 kDa CP功能結構域有2個分別位于第13位到第73氨基酸和第102位到第316位氨基酸之間的序列，Peptidase C1A家族的功能結構域一般在第10位到第317位氨基酸之間,見圖6。

圖5 Blastn中27 kDa-CP基因同源性分析Fig.5 Homology analysis of 27 kDa-CP gene in Blastn

圖6 27kDa-CP結構域預測Fig.6 Domains prediction for 27 kDa-CP

3 討 論

半胱氨酸蛋白酶廣泛地存在于人類、寄生蟲等多種動物體內。在寄生蟲生活史中起關鍵作用，目前研究主要涉及該酶參與蟲體的入侵、移行、營養吸收和免疫逃避等多個方面。

Sogorb MA等通過對衛氏并殖吸蟲的研究發現，CP能降解結締組織的主要成分，表明CP有利于蟲體對宿主組織的破壞和易于蟲體的入侵及移行[17]。Berasain P等證明了肝片吸蟲組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶1，2能通過降解宿主細胞外基質和基底膜分子，促進寄生蟲自身移動[18]。Kong Y等[13]研究發現猬迭宮絳蟲裂頭蚴分泌的27 kDa CP通過將IgG裂解成Fab和Fc片段參與該蟲的免疫逃避。最近，余長茂對廣州管圓線蟲3種半胱氨酸蛋白酶(Ac-CathB-1、Ac-CathB-2、Ac-Hem)進行了組織定位研究，發現Ac-CathB-1和Ac-CathB-2在一期幼蟲到成蟲的消化系統均有分布，其中在成蟲腸道上皮微絨毛層的分布更為集中，推測Ac-CathB-1 和Ac-CathB-2可能參與蟲體的營養攝取[19]。

本研究通過NCBI的Blastn在線分析，27 kDa CP的編碼cDNA屬于Peptidase_C39_like超家族。Peptidase_C39_like超家族在細菌、古生菌、原生動物、真菌、植物、動物及病毒中均有發現。Peptidase C1A家族包含許多肽鏈內切酶和一些外肽酶，催化類型和半胱氨酸蛋白酶一致，而27 kDa CP基因的結構預測與Peptidase C1A家族的蛋白結構類似，說明27 kDa CP可能具有半胱氨酸蛋白酶的催化活性。

對猬迭宮絳蟲27 kDa CP進行克隆表達和純化，所獲重組蛋白的分子量與理論值相似。分子量約為35 kDa，與從蟲體提取純化得到的天然半胱氨酸蛋白酶(27 kDa)在分子量上不一致，其原因可能是在原核表達時，未發生真核體內表達的基因轉錄后加工過程，產生的重組蛋白實際上是半胱氨酸蛋白酶前體[20]。

前期研究發現，猬裂頭蚴皮層可溶性蛋白經SDS-PAGE共分離出12條蛋白帶，相對分子質量(Mr)范圍在98～178 kDa，其中Mr24.5、35、50、170 kDa為高豐度蛋白區帶。經Wester Blotting分析，2條帶(Mr15和35 kDa)為猬裂頭蚴皮層特異性蛋白條帶，能被感染小鼠血清識別。本次重組蛋白經Western blotting分析，也在Mr35 kDa處出現特異蛋白條帶，可被裂頭蚴感染血清識別。推測猬裂頭蚴皮層是半胱氨酸蛋白酶主要表達的部位，這與裂頭蚴的入侵、移行和營養的攝取等有一定的關系。另外，實驗的結果將為進一步研究猬裂頭蚴半胱氨酸蛋白酶的功能及尋找猬裂頭蚴的診斷抗原奠定了基礎。

[1] Chen Y. Hazards and controls of food-brone parasitic diseases[M].Guiyang: Guizhou Science and Technology Publishing House, 2010:216. (in Chinese)

陳艷. 食源性寄生蟲病的危害與防治[M]. 貴陽:貴州科技出版社,2010:216.

[2] Chen Y. Hazards and controls of food-brone sparagnosis [M].Guiyang: Guizhou Science and Technology Publishing House, 2013：1. (in Chinese)

陳艷. 食源性裂頭絳蟲病的危害與防治[M]. 貴陽:貴州科技出版社,2013：1.

[3] Cheng M, Yang X, Li ZY, et al. Cloning and characterization of a novel cathepsinB-like cysteine proteinase fromAngiostrongyluscantonensis[J]. Parasitol Res, 2012, 110(6): 2413-2422. DOI: 10.1007/s00436-011-2780-y

[4] Sako Y, Nakaya K, Ito A.Echinococcusmultilocularis: Identification and functional characterization of cathepsin B-like peptidases from metacestode[J]. Exp Parasitol, 2011, 127(3): 693-701. DOI: 10.1016/j.exppara.2010.11.005

[5] Lee JY, Kim JH, Sohn HJ, et al. Novel cathepsin B and cathepsin B-like cysteine protease ofNaegleriafowleriexcretory-secretory proteins and their biochemical properties[J]. Parasitol Res, 2014, 113(8): 2765-2776. DOI: 10.1007/s00436-014-3936-3

[6] Guiliano DB, Hong X, Mckerrow JH, et al. A gene family of cathepsin L-like proteases offilarialnematodesare associated with larval molting and cuticle and eggshell remodeling[J]. Mol Biochem Parasitol, 2004, 136(2): 227-242. DOI: 10.1016/j.molbiopara.2004.03.015

[7] Loukas A, Selzer PM, Maizels RM. Characterisation of Tc-cpl-1, a cathepsin L-like cysteine protease fromToxocaracanisinfective larvae[J]. Mol Biochemic Parasitol, 1998, 92(2): 275-289. DOI:10.1016/S0166-6851(97)00245-4

[8] Park H, Kim S, Hong KM, et al. Characterization and classification of five cysteine proteinases expressed byParagonimuswestermaniadult worm[J]. Exp Parasitol, 2002, 102(3): 143-149. DOI: 10.1016/S0014-4894(03)00036-5

[9] Estrela A, Seixas A, Termignoni C. A cysteine endopeptidase from tick (Rhipicephalus(Boophilus)microplus) larvae with vitellin digestion activity[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2007, 148(4): 410-416. DOI: 10.1016/j.cbpb.2007.07.009

[10] Liu LN, Cui J, Qi X, et al. Theinvitroexpression conditions ofSpirometramansonicysteine protease[J]. J Pathog Biol,2015,10(8):717-720. (in Chinese)

劉莉娜,崔晶,祁欣,等. 曼氏迭宮絳蟲半胱氨酸蛋白酶體外表達條件的優化[J]. 中國病原生物學雜志,2015,10(8):717-720.

[11] Jiang WC, Xu XZ, Shen MX, et al. Evaluation on effect of detecting Clonorchiasis with ELISA coated by the antigen of cysteine protease[J].J Pathog Biol,2013,8(11):1011-1013. (in Chinese)

江文才,徐祥珍,沈明學,等. 華支睪吸蟲半胱氨酸蛋白酶ELISA檢測方法的建立及其應用效果評價[J]. 中國病原生物學雜志,2013,8(11):1011-1013.

[12] Hu DD, Cui J, Wang L, et al. A Study of antigens for early diagnosis of infection withSpirometramansonispargana[J]. J Pathog Biol,2013,8(11):993-996. (in Chinese)

胡丹丹,崔晶,王莉,等. 曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴感染早期診斷抗原的研究[J]. 中國病原生物學雜志,2013,8(11):993-996.

[13] Kong Y, Chung YB, Cho SY, et al. Cleavage of immunoglobulin G by excretory-secretory cathepsin S-like protease ofSpirometramansoniplerocercoid[J]. Parasitology, 1995, 109(Pt 5)(4): 611-621. DOI:10.1017/S0031182000076496

[14] Song CY, Chappell CL. Purification and partial characterization of cysteine proteinase fromSpirometramansoniplerocercoids[J]. J Parasitol,1993, 79(4): 517-524.

[15] Kong Y, Kang SY, Kim SH, et al. A neutral cysteine protease ofSpirometramansoniplerocercoid invoking an IgE response[J]. Parasitology,1997,114(Pt3):263-271.DOI: 10.1017/S0031182096008529

[16] Kong Y, Yun DH, Cho SY, et al. Differential expression of the 27 kDa cathepsin L-like cysteine protease in developmental stages ofSpirometraerinacei[J]. Korean J Parasitol, 2000, 38(3): 195-199. DOI: 10.3347/kjp.2000.38.3.195

[17] Sogorb MA, Bas S, Gutierrez LM, et al. Critical roles for excretory-secretory cysteine proteases during tissue invasion ofParagonimuswestermaninewly excysted metacercariae[J]. Cell Microbiol, 2006, 8(6): 1034-1046. DOI: 10.1111/j.1462-5822.2006.00685.x

[18] Berasaín P, Goni F, McGonigle S, et al. Proteinases secreted byFasciolahepaticadegrade extracellular matrix and basement membrane components[J]. J Parasitol, 1997, 83(1): 1-5.

[19] Yu CM. Immunofluorescence of three kinds of Cathepsins in of each stage ofAngiostrongyluscantonensis[D].Xiamen: Xiamen University, 2013.(in Chinese)

余長茂. 廣州管圓線蟲三種半胱氨酸蛋白酶在其各期蟲體中的免疫熒光[D]. 廈門:廈門大學,2013.

[20] Liu DW, Kato H, Nakamura T, et al. Molecular cloning and expression of the gene encoding a cysteine proteinase ofSpirometraerinacei[J]. Mol Biochem Parasitol,1996,76(1/2):11-21. DOI: 10.1016/0166-6851(95)02522-7

Cloning, expression and bioinformatics analysis of 27 kDa cysteine protease gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid

JIAO Meng-han, LIU Yan-dan, CHEN Yan, LI Jin-fu

(DepartmentofParasitology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

To clone and express 27 kDa cysteine protease (CP) gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid, and analyze the biology characteristics, a total of RNA was extracted from the plerocercoids and reversely transcribed into cDNA. The 27kDa-CP gene was amplified by PCR and cloned into pM-19T vector for sequencing. The accurate sequence was subcloned into the expression vector pET-28a (+). The recombinant plasmid was transformed into Transetta (DE3) and the expression protein induced by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni2+ affinity chromatography, and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The 27 kDa CP gene and its expression protein were predicted and analyzed by bioinformatics analysis tools such as NCBI and ExPASy. Results showed that the ORF length of 27 kDa CP gene sequence was 1 011 bp, and the removed signal peptide sequence was 954 bp with the submission number of ANA52569 in GenBank. The whole sequence of 27 kDa CP (Mr 35 669.9, pI 5.92) was 317 amino acids conferred from cDNA, which belongs to the Peptidase_C39_like superfamily. The pET-28a (+)-27kDa-CP was expressed under the induction of IPTG. Western blotting analysis showed that the purified protein reach expectancy, and had better response with positive serum ofSpirometraerinaceiplerocercoid infection. In conclusion, the 27 kDa CP gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid is successfully cloned and expressed and knowing coded sequences and bioinformatic.

Spirometraerinacei; pleroceroid; cysteine protease gene; prokaryotic expression; bioinformatics

Chen Yan, Email: chenyan757@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.006

，陳艷，Email:chenyan757@sina.com

貴州醫科大學人體寄生蟲學教研室,貴陽 550004

R383

A

1002-2694(2017)02-0120-06

2016-07-28 編輯： 李友松

貴州省科技廳社會發展攻關項目(No.20143024)資助

Supported by the Science and Technology Department of Guizhou Province (No. 2014-3024)