遼寧省朝陽市細粒棘球病的基因型分析

王曉黎，李 飛，李金慧，劉 靜，李亞彩，白 楊，安春麗

遼寧省朝陽市細粒棘球病的基因型分析

王曉黎1，李 飛2，李金慧1，劉 靜1，李亞彩1，白 楊1，安春麗3

目的 分析本院分離到的人源性棘球蚴的基因型，為遼寧省棘球蚴病的分子流行病學提供資料。方法 經外科手術方法從患者肝內獲取棘球蚴囊，將囊內容物離心沉淀提取DNA，以細粒棘球絳蟲線粒體細胞色素氧化酶(cox1)基因為靶基因設計引物進行PCR擴增，對PCR產物進行測序，測序結果應用Blast進行分析，并與GenBank數據庫中序列進行比對。結果cox1擴增產物及測序的結果提示，本例樣本與細粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差異性為0.1%，基因型屬于G1亞型。并與其他國家的25個分離株序列一致。結論 線粒體基因組的cox1基因分析是棘球蚴病診斷和分型的有力工具。遼寧地區首次報道了細粒棘球絳蟲的基因型為G1亞型，其序列與國內外的多個分離株保持一致，為棘球蚴病的分子流行病學補充了資料。

細粒棘球蚴；cox1基因；基因型；分子流行病學

棘球蚴病(echinococciosis)是一種流行廣泛，危害人類、家畜及野生動物的人獸共患蠕蟲病。據世界衛生組織(WHO)報告，細粒棘球絳蟲流行在南美，東歐，俄羅斯，中東和中國等廣大地區流行嚴重，已經成為一個嚴重的世界性公共衛生問題[1-4]。我國為棘球蚴病發病率高發的國家之一，目前已有25個省、自治區有病例報道，其中四川、新疆、青海、西藏的牧區發病率最高[5]。在長期的進化演變過程中，棘球蚴病流行區地理氣候多樣性及其中間宿主多樣性，使寄生蟲在與宿主之間的互相適應中發生著變異。各地區人及動物體內分離到的棘球蚴的基因型有差異[6-8]。不同基因型不僅在形態學，發育過程有差異，而且對宿主特異性、人類感染力及致病性等方面都相差很大[9]。了解棘球絳蟲的物種分類及基因型，可以促進其地理分布，寄主范圍，防治策略以及對人類健康的影響等方面的研究。我國西北及中西部流行區人及動物的流行株及其基因型已有報道[10]，東北黑龍江地區的流行株及基因型也有描述[11]。但遼寧地區流行的基因型尚未見報道，本文就中國醫科大學附屬第一醫院收治并分離到的棘球蚴進行了基因型分析。

1 材料方法

1.1 標本來源 患者，女，57歲，遼寧省朝陽市居民，20年前曾居住朝陽農村(非牧區)，無確切動物接觸史。2015年6月因自覺右上腹不適，時有牽拉隱痛等癥狀就診于中國醫科大學第一臨床學院肝膽外科，肝膽CT檢查發現肝臟右葉腫物，約10×10 cm，影像呈多囊性蜂房樣(參照WHO CT分型為CE2型)，診斷為肝包蟲病并行手術切除治療。患者簽署知情同意書，醫院倫理委員會同意本研究項目。1.2 病原學鑒定 將手術切除的完整囊性腫物在安全保護下切一小口，抽取囊內容物置于10 mL離心管內，自然沉淀后，取沉淀物顯微鏡檢查，以查到典型的棘球蚴典型的原頭節為病原學鑒定依據。1.3 DNA提取 將上述包含原頭節的組織命名為分離株SY-1，用QIAamp DNA Mini Kit(51304)試劑盒，按照組織標本說明書方法提取DNA，置4 ℃保存。

1.4 引物設計及PCR擴增 根據參考文獻[12]報道的細粒棘球蚴cox1基因的引物序列：上游引物(cox1-F)：5′-TTGTTAGGTGGTTTGTCTGA-3′下游引物(cox1-R)：5′-GGCCATCACAAATAAACA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增片段為895 bp，包含了常用于cox1基因型分析的部分片段。PCR反應體系：總體積為25 μL，2×TaqPCRMasterMix 12.5 μL，引物cox1-F、cox1-R(10 pmol/μL)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，51 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 測序及基因型分析 PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司，按目的要求進行測序。應用DNAman軟件對測序結果與GenBank中的cox1[Echinococcusgranulosus](Gene ID:4097469)序列進行比較分析。

2 結 果

2.1 標本形態學及病理學鑒定 患者經肝膽脾CT掃描顯示肝右葉囊性病變，膽胰管MR水成像提示肝內囊性占位。經手術切除腫物，病理學檢查發現纖維囊壁組織，符合包蟲病的病理所見。

A.原頭蚴(頂突外翻)；B.囊內容物中可見大量棘球蚴特征性的小鉤A.Evaginated protoscolex; B. Characteristic hookets of hedatid圖1 棘球蚴的病原學鑒定Fig.1 Pathogenic identification of E.granulosus

2.2 病原學鑒定 囊內容的沉淀物經光學顯微鏡檢查，發現典型的原頭節，即原頭蚴(圖1A)和大量棘球蚴特征性的小鉤(圖1B)，病原學鑒定為棘球蚴。2.3 PCR擴增結果 如圖2所示，在1 000 bp左右處出現特異條帶，符合目的基因片段的大小。

M：DL-2 000分子量標記；S：病例樣本(1 000 bp處出現特異條帶)；N：為陰性對照M：DL-2 000 marker；S：sample of patient(specific band at 1 000 bp)；N：negative control 圖2 分離株SY-1的cox1基因PCR產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis result of E. granulosus cox1 gene PCR product

2.4 測序及基因型分析 將分離株SY-1的測序結果應用pubmed的Blast工具分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，發現147條同源序列(E value=0,相似度99%～100%)，均為細粒棘球絳蟲種屬。應用DNAman軟件將測序結果與GenBank中細粒棘球絳蟲(E.granulosus)線粒體基因組(AF297617)中的cox1基因 (Gene ID:4097469)序列進行比較分析，900 bp中僅有1 bp不同，為位于第855位堿基T→C，對應編碼285位氨基酸絲氨酸無變化(AGT/AGC)，變異率為0.1%。分離株SY-1的核苷酸序列與GenBank數據庫中的來源于不同國家的25條單倍體序列完全一致，見表1、圖3。

表1 GenBank中與分離株SY-1序列一致的分離株來源
Tab.1 Strains whose sequences are consistent with SY-1 in GenBank

分離株名稱HaplotypesGenBank登錄號Accessionnumbers來源Localities宿主hosts參考文獻ReferencesEgAus04KT968705.1澳大利亞[13]H2KJ628363.1中國西藏綿羊未發表H9KJ628364.1中國西藏綿羊未發表BG4KR337821.1伊朗山羊未發表BG1KR337819.1伊朗山羊未發表EgMGL9AB893250.1蒙古人[14]EgMGL7AB893248.1蒙古人[14]EgMGL4AB893245.1蒙古人[14]EgMGL3AB893244.1蒙古人[14]EgRUS11AB777908.1俄羅斯人[15]EgRUS10AB777907.1俄羅斯人[15]EgRUS7AB777904.1俄羅斯人[15]H10AB787547.1蒙古人未發表H08AB787545.1蒙古人未發表H07AB787544.1蒙古人未發表H06AB787543.1蒙古人未發表H05AB787542.1蒙古人未發表H04AB787541.1蒙古人未發表H03AB787540.1蒙古人未發表52LI07AB786664.1中國四川人[16]EG40AB688617.1中國人[17]EG39AB688616.1中國人[17]EG33AB688610.1中國人[17]EG31AB688608.1中國人[17]EG17AB688594.1中國人[17]EG14AB688591.1中國人[17]Eg01JQ250806.1伊朗綿羊[17]-AB622277.1俄羅斯家貓[18]Sq2AY377836.1中國人未發表

圖3 分離株SY-1的COX1基因與細粒棘球絳蟲線粒體基因組(AF297617)進行對比結果Fig.3 Comparison of COX1 gene between SY-1 strain and mitochondrial genomes of E.granulosus (AF297617)

3 討 論

研究表明，不同種屬及不同基因型絳蟲的地理分布，流行特征以及對宿主特異性、對人類感染力及致病性等方面都具有很大相差[6-9]。了解棘球絳蟲的基因型，可以促進其地理分布，寄主范圍，防治策略以及對人類健康的影響等方面的研究。因此，有關棘球絳蟲種屬及種下分類一直備受關注。以前普遍認為棘球絳蟲只有細粒棘球絳蟲(E.granulosus)和多房棘球絳蟲(E.multilocularis)兩種。并根據形態學將兩種絳蟲的中絳期(metacestode)幼蟲引起的棘球蚴病分為單房(囊型)棘球蚴病(cystic echinococcosis，即包蟲病)和多囊(泡狀)棘球蚴病(Alveolar hydatid disease)[19]。其間，E.granulosus曾被視為是一個具有基因型和表型多態性的單一物種，并按基因序列將其分為10個基因型(G1-G10)[20-21]。然而，近年來依據進化系統發育學(phylogenetic systematics)建立起來的棘球絳蟲分類方法已經替代并修正了傳統的形態學分類標準。如，Nakao等[22]研究認為導致囊型包蟲病的細粒棘球絳蟲其實是一個隱含了多個蟲種的復雜的神秘物種；并且將原來的兩種棘球絳蟲重新分為9個有效種。Spotin[23]等基于系統發育學和地理株理論，對棘球絳蟲的線粒體和核糖核DNA基因進行系統研究，結果認為原先的廣義細粒棘球絳蟲至少包括4個有效種：即E.granulosus(狹義細粒棘球絳蟲，基因型G1-G3)、E.equinus(G4)、E.ortleppi(G5)和E.canadensis。其中E.canadensis具有高度異質性，包括有駱駝株(基因型G6)、豬株(基因型G7)和兩個鹿株(基因型G8和G10)。G9基因型的有效性受到質疑。其中G1基因型絳蟲分布最廣泛，呈世界性流行，羊是其最常見的中間宿主。全球絕大多數(88.44%)囊型包蟲病是由基因型G1所致；全球大約11.07%的人體包蟲病由與G1親緣關系密切的G6和G7基因型感染所致。其中，7.34%囊型包蟲病例屬于G6基因型，主要分布于非洲和亞洲，中間宿主主要是駱駝和山羊。3.73%屬于G7型，其中間宿主為豬，主要流行于東歐國家。人體包蟲病罕見由G5、G8和G10型引起。尚未發現有G4感染人類的報道。我國西北及中西部，如青海省、甘肅省和新疆維吾爾自治區等地流行株主要以G1為主[10，24-27]，東北的黑龍江發現有G1和G7基因型病例報道[11]。

線粒體DNA(mtDNA) 結構簡單、穩定、以母系方式遺傳，核苷酸歧異度大、進化速度快，在種內、種間、群體間和群體內具有廣泛的多態性，可以作為一個可靠的遺傳標記。根據對基因的全序列變異分析，可以更全面、準確地了解包蟲病的流行特征，并對該病的預防和控制提供理論支持。本研究首次對中國遼寧省西部朝陽地區的1例患者肝內囊性占位病變進行了病原學鑒定，在確診細粒棘球蚴病的基礎上，通過分子生物學的基因分析，確定為細粒棘球絳蟲G1型,變異率為0.1%，變異核苷酸并未影響到編碼氨基酸序列。并且該序列與澳大利亞、俄羅斯、伊朗、蒙古以及國內其他地區的分離株單倍體序列相同，為我國包蟲病的病原流行病學提供了新的資料。

[1] Pakala T, Molina M, Wu GY. Hepatic echinococcal cysts: A review[J]. J Clin Transl Hepatol, 2016, 4(1): 39-46.

[2] Rossi P, Tamarozzi F, Galati F, et al. The first meeting of the european register of cystic echinococcosis (ERCE)[J]. Parasit Vectors.2016, 28; 9:243.

[3] Cadavid Restrepo AM, Yang YR, McManus DP, et al. The landscape epidemiology of echinococcosis[J]. Infect Dis Poverty, 2016, 5: 13.

[4] van Cauteren D, Millon L, de Valk H, et al. Retrospective study of human cystic echinococcosis over the past decade in France, using a nationwide hospital medical information database[J]. Parasitol Res, 2016, 115(11): 4261-4265.

[5] Wen H, Tuerganaili A, Shao YM, et al. Achievements and challenges for echinococcosis control[J]. Chin J Parsitol Paraist Dis, 2015，33(6): 466-471. (in Chinese)

溫浩，吐爾干戈力·阿吉，邵英梅等. 棘球蚴病防治成就及面臨的挑戰[J]. 中國寄生蟲病防治雜志, 2015，33(6):466-471 .

[6] Ito A, Nakao M, Lavikainen A, et al. Cystic echinococcosis: Future perspectives of molecular epidemiology[J]. Acta Trop, 2016, pii: S0001-706X(16)30242-X.

[7] Romig T, Ebi D, Wassermann M. Taxonomy and molecular epidemiology ofEchinococcusgranulosussensu lato[J]. Vet Parasitol, 2015, 213(3/4): 76-84.

[8] McManus DP. Current status of the genetics and molecular taxonomy ofEchinococcusspecies[J]. Parasitology, 2013, 140(13): 1617-1623.

[9] Alvarez Rojas CA, Romig T, Lightowlers MW.Echinococcusgranulosussensu lato genotypes infecting humans-review of current knowledge[J]. Int J Parasitol, 2014, 44(1): 9-18.

[10] Hu D, Song X, Wang N. et al. Molecular identification ofEchinococcusgranulosuson the Tibetan Plateau using mitochondrial DNA markers[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(4): 13915-13923.

[11] Zhang T, Yang D, Zeng Z, et al. Genetic characterization of human-derived hydatid cysts ofEchinococcusgranulosussensulato in Heilongjiang Province and the first report of G7 genotype ofE.canadensisin humans in China[J]. PLoS One, 2014, 9(10): e109059.

[12] Yu JF, Li B, Liu XS, et al. Cloning and sequence analysis of the partialCO1 gene with in mitochondria DNA ofEchinococcusgranulosus[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(6): 532-536. (in Chinese)

于晶峰, 李濱, 劉曉松, 等.細粒棘球蚴線粒體CO1基因的克隆與序列分析[J]. 中國人獸共患病學報, 2015, 31(6): 532-536.

[13] Alvarez Rojas CA, Ebi D, Gauci CG, et al. Microdiversity ofEchinococcusgranulosussensu stricto in Australia[J]. Parasitology, 2016, 143(8): 1026-1033.

[14] Ito A, Dorjsuren T, Davaasuren A, et al. Cystic echinococcoses in Mongolia: molecular identification, serology and risk factors[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(6): e2937.

[15] Konyaev SV, Yanagida T, Nakao M, et al. Genetic diversity ofEchinococcusspp. in Russia[J]. Parasitology, 2013, 140(13): 1637-1647.

[16] Nakao M, Yanagida T, Konyaev S, et al. Mitochondrial phylogeny of the genusEchinococcus(Cestoda: Taeniidae) with emphasis on relationships amongEchinococcuscanadensisgenotypes[J]. Parasitology, 2013, 140(13): 1625-1636.

[17] Yanagida T, Mohammadzadeh T, Kamhawi S, et al. Genetic polymorphisms ofEchinococcusgranulosussensu stricto in the Middle East[J]. Parasitol Int, 2012, 61(4): 599-603.

[18] Konyaev SV, Yanagida T, Ivanov MV, et al. The first report on cystic echinococcosis in a cat caused byEchinococcusgranulosussensu stricto (G1) [J]. J Helminthol, 2012, 86(4): 391-394.

[19] Pakala T, Molina M, Wu GY. Hepatic echinococcal cysts: A review[J]. J Clin Transl Hepatol, 2016, 4(1): 39-46.

[20] Bowles J, Blair D, McManus DP. Genetic variants within the genusEchinococcusidentified by mitochondrial DNA sequencing[J]. Mol Biochem Parasitol, 1992, 54: 165-173.

[21] Bowles J, McManus D, Donald P. Molecular variation inEchinococcus[J]. Acta Trop, 1993, 53: 291-305.

[22] Nakao M, Lavikainen A, Yanagida T, et al. Phylogenetic systematics of the genusEchinococcus(Cestoda: Taeniidae) [J]. Int J Parasitol, 2013, 43(12/13): 1017-1029.

[23] Spotin A, Mahami-Oskouei M, Harandi MF, et al. Genetic variability ofEchinococcusgranulosuscomplex in various geographical populations of Iran inferred by mitochondrial DNA sequences[J]. Acta Trop, 2016, pii: S0001-706X(16)30092-4.

[24] Yang YR, Rosenzvit MC, Zhang LH, et al. Molecular study ofEchinococcusin west-central China[J]. Parasitology, 2005, 131(Pt 4): 547-555.

[25] Wang N, Gu XB, Wang T, et al. Genetic variability ofEchinococcusgranulosusdetermined by the mitochondrial cytochrognme coxidase subunit 1 gene in the Tibet plateau of China[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2015, 46(3): 453-460. (in Chinese)

王凝, 古小彬, 汪濤, 等. 基于COX1基因對中國青藏高原地區細粒棘球絳蟲遺傳多態性的研究[J]. 畜牧獸醫學報，2015，46(3)：453-460.

[26] Yang JK, Jia WZ, Jing T, et al. Analysis ofE.granulosusgene variation in three provinces in china[J]. Chin J Vet Sci Technol, 2004, 34(9): 12-16. (in Chinese)

楊俊克，賈萬忠，景濤，等．我國三省區細粒棘球絳蟲基因的變異分析[J].中國獸醫科技，2004,34(9):12-16.

[27] Cao DP, Fan HN, Wu DF, et al. Phylogeny of Qinghai plateauEchinococcusgranulosusisolates inferred by cytochromeoxidase 1 gene sequences[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(10): 1048-1051. (in Chinese)

曹得萍，樊海寧，毋德芳，等.利用細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ分析青海藏區細粒棘球絳蟲系統發育學[J]. 中國人獸共患病學報[J], 2014,30(10):1048-1051.

Genetic analysis ofEchinococcusgranulosusstrain in Liaoning Province, China

WANG Xiao-li1, LI Fei2, LI Jin-hui1, LIU Jing1, LI Ya-cai1, BAI Yang1，An chun-li3

(1.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,InstituteofEndocrinology,KeyLaboratoryofEndocrineDiseasesofLiaoningProvince,theFirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China; 2.DepartmentofGastroenterologyandEndocrinology,HospitalofTacheng,ChinaMedicalUniversity,Tacheng834799,China；
3.DepartmentofMicrobiologyandParasitology,CollegeofBasicMedicalScience,ChinaMedicalUniversity,Shenyang, 110001，China

To analyze the genotype ofEchinococcusgranulosusfound in Liaoning Province, hydatid cyst was taken from the patient's liver, DNA of cyst was isolated and mitochondrialcox1 gene was sequenced substantially. Sequence results was analyzed by Blast and compared with similar strains in GenBank. Results showed that molecular analysis confirmed the echinococcosis by identical sequence of our strain withE.granulosus(AF297617) G1 genotype, with 0.1% difference. And the sequence of our strain was consistent with 25 other strains in different countries. In conclusion, genotyping of mitochondrial genecox1 is a very useful tool for diagnosis of echinococcosis. We first reported a strain ofE.granulosusin Liaoning Province, which provide novel molecular epidemiological data of this zoonosis.

Echinococcusgranulosus; Cox1 gene; genotype; molecular epidemiology

Wang Xiao-li, Email: wlittlepear@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.004

國家自然科學基金(No.81370189)和國家自然科學基金青年基金(No.81302271)聯合資助

，安春麗，Email: cmucl@126.com

1.中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001； 2.中國醫科大學塔城醫院消化內分泌科，塔城 834799； 3.中國醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，沈陽 110001

R383

A

1002-2694(2017)02-0110-05

2016-09-05 編輯：梁小潔

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81370189)