超聲輔助提取兔皮膠原蛋白及其理化特性

張曉潔 張宇昊 馬 良 馬明思 鄭 紅 孫 藝

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715)

超聲輔助提取兔皮膠原蛋白及其理化特性

張曉潔1張宇昊1馬 良2馬明思2鄭 紅2孫 藝2

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715)

以兔皮為原料，研究超聲波在酶法提取膠原蛋白中的應用。結果表明，超聲輔助制得的膠原蛋白的提取率為(83.69±0.51)%，與傳統酶法相比提高了25%。聚丙烯酰氨凝膠電泳結果表明，超聲處理制得的兔皮膠原蛋白主要由α1，α2和β亞基組成，并未造成亞基的降解；紫外光譜表明，超聲處理后的膠原蛋白的特征吸收波長為217 nm，說明其較好地保持了I型膠原蛋白的特征；傅立葉變換紅外光譜表明，經過超聲處理后的膠原蛋白分子中的氫鍵遭到部分破壞，但其三螺旋結構仍保持完整；差示掃描量熱儀結果表明，超聲法制得的兔皮膠原蛋白的熱變性溫度和熱焓值均略低于傳統兔皮膠原，相對而言仍具有較高的熱穩定性。

兔皮；膠原蛋白；超聲波；理化特性

膠原蛋白作為一種纖維蛋白，是細胞外基質的主要組成成分，廣泛分布于結締組織、皮膚、骨骼和韌帶等部位，起著支撐器官、保護機體的功能，約占總蛋白的30%左右[1]。膠原蛋白及其水解物具有良好的乳化性、起泡性和低免疫原性，這使其在食品方面[2]、生物醫學[3]和化妝品等領域有廣泛的應用。

目前，膠原蛋白的提取方法主要有中性鹽萃取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法等，其中，酶法應用最為廣泛，酶法提取是利用蛋白酶對膠原纖維的末端肽進行降解，使肽鍵斷裂，再將含有三螺旋結構的主體部分溶解于稀醋酸中而被提取出來。由于酶切位點有限以及端肽中存在較強的共價交聯，使得酶解效率較低，提取周期較長[4]。

超聲波提取技術作為一種環境友好型新技術，因其具有提取時間短、能耗少、提取液中雜質少、對有效成分破壞較小等優點[5]，在當今的生產、生活和科學研究中被廣泛使用。在超聲波輔助提取過程中，快速形成的空化泡破裂時會對介質產生機械、化學和熱效應作用，從而顯著提高目標物質的提取效率[6-7]。近年來，對于超聲輔助提取膠原蛋白方面已經有一些報道，Ran等[8]用超聲輔助胃蛋白酶提取牛跟腱中膠原蛋白，酸浸泡12 h后，在超聲功率750 W，頻率20 kHz條件下，先超聲處理18 h，再加入胃蛋白酶酶解30 h，與常規酶解48 h相比，提取率提高了154.17%。Kyung等[9]將超聲用于酸法提取鱸魚皮中的膠原蛋白，在超聲功率150 W，頻率20 kHz條件下，酸浸泡超聲處理24 h，與傳統酸法提取24 h相比，膠原蛋白的提取率提高了116.65%，但凝膠電泳結果表明，膠原發生了降解。這說明，適度超聲可以提高膠原蛋白的產率，但超聲處理過程中所產生的機械和熱效應會導致膠原發生降解。

本研究擬以高蛋白低脂肪的兔皮為原料，考察料液比和超聲時間對兔皮膠原蛋白提取率的影響，旨在提高膠原蛋白的產率，并對其理化性質進行研究，以期為其高效生產和潛在應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

兔皮：膠原蛋白含量為(13.82±0.24) g/100 g，重慶阿興記食品有限公司，原料獲取后洗凈凍藏于-20℃冰箱中備用；

氫氧化鈉、氫氧化鈣、冰醋酸、鹽酸、硫化鈉、氯化鈉、溴化鉀、十二烷基硫酸鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

β-巰基乙醇(2-ME)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)：分析純，美國BIO BASIC 公司；

Tris、考馬斯亮藍 R-250：優級純，美國BIO BASIC 公司；

胃蛋白酶(1∶10 000)：酶活800～2 500 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

30%丙烯酰胺：優級純，北京索萊寶科技有限公司；

標準蛋白：分子質量 10～200 kDa，加拿大Fermentas公司。

1.1.2 主要儀器設備

超聲波細胞破碎儀：JY92-IIDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

電子天平：JA3003B型，上海精天電子儀器有限公司；

料理機：FYL-C020E型，九陽股份有限公司；

實驗室pH計：PE20型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；

大功率磁力攪拌器：99-1型，金壇市科析儀器有限公司；

臺式高速離心機：5810 型，德國Eppendorf 公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ-B型，上海將任實驗設備有限公司；

真空冷凍干燥機：FD-1-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

基礎電泳儀：Power PacTM型，美國Bio-Rad 公司；

凝膠成像系統：G: BOX EF 型，英國 Syn-gene 公司；

差示量熱掃描儀：Pyris4000型， 美國PerkinElmer 公司；

紫外可見分光光度計：752型，上海箐華科技有限公司；

紅外光譜儀：Spectrun100型，美國PerkinElmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶法提取兔皮膠原蛋白

新鮮兔皮→預處理→去除雜蛋白(用質量濃度為10 g/L 的 NaCl 溶液處理，浸泡攪拌6 h，每2 h 換1次液)→清洗→酸浸泡(在4℃下于pH 2.2的醋酸溶液中浸泡8～10 h)→打漿→胃蛋白酶酶解(酶解液的pH 1.9，酶用量1%，酶解時間4 h)→中和、鹽析(使NaCl最終濃度為4～5 mol/L，鹽析12 h)→純化(以 pH 3.0的醋酸溶液為透析液透析1 d，再以純水為透析液透析2 d)→凍干→膠原蛋白[10]

1.2.2 超聲輔助酶法提取兔皮膠原蛋白 在1.2.1的基礎上稍作調整，酸浸泡打漿后先超聲處理，再酶解。超聲處理基本條件為：超聲功率45%(總功率650 W)，頻率為20 kHz，工作5 s，間隔5 s，超聲時間30 min，料液比1∶15(g/mL)；重點考察料液比和超聲時間對膠原蛋白提取率的影響，料液比水平設置為：1∶10，1∶15，1∶30(g/mL)，超聲時間水平設置為：0，10，20，25，30，60 min。

1.2.3 膠原蛋白提取率的計算

(1)

式中：

C——膠原蛋白的提取率，%

m1——膠原蛋白的凍干重量，g；

m2——兔皮的凍干重量，g。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 稱取 2 mg 膠原蛋白溶解于 1 mL Tris—HCl(pH 8.0)溶液中[9]，使其蛋白濃度為2 mg/mL，其中分離膠和濃縮膠的濃度分別為 6%和5%，具體操作步驟參照文獻[11]。染色完成并脫色后，采用 Gene Tools 數據處理軟件對電泳圖譜進行分析。

1.2.5 紫外光譜分析 以0.05 mol/L醋酸為溶劑，將膠原蛋白樣品溶于其中，配制濃度為0.5 mg/mL的溶液，取0.05 mol/L的醋酸溶液作為空白，對樣品在190～400 nm的近紫外光區進行掃描[12]。

1.2.6 紅外光譜(FT-IR)分析 稱取1 mg樣品與150 mg溴化鉀(KBr)置于瑪瑙研缽中充分混勻研磨，烘干后進行壓片，用傅立葉紅外光譜儀在450～4 000 cm-1范圍內進行測定，具體參數設置參照文獻[13]。

1.2.7 熱穩定性分析 準確稱量樣品3～5 mg，密封于鋁鉗鍋中，在氮氣環境下，以5℃/min的速率進行加熱，測定溫度范圍為-5～200℃，記錄差示量熱掃描(DSC)圖譜并進行分析[14]。

1.2.8 數據分析 每組試驗設置3個平行，所得數據均采用origin 8.6和 SPSS 17.0軟件進行分析，以平均值±標準偏差來表示。

2 結果與分析

2.1 料液比對膠原蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲料液比的增加，膠原蛋白的提取率先增加后降低。超聲波的機械效應和空化作用有利于溶劑的滲透和擴散[15]，在料液比為1∶10(g/mL)時，溶液粘度較大，不利于超聲空化作用的傳導，膠原蛋白分子的溶出速率較低；隨著液料比增加，當料液比為1∶15(g/mL)時，稀釋作用加強，溶液的粘度和蛋白濃度都有所下降，超聲波的強烈振動和空化效應增加，使得膠原纖維結構得以松散，促使分散的膠原分子溶解于稀醋酸中，因而提取率有顯著提高(P<0.05)；當料液比為1∶30(g/mL)時，溶液體積的增加反而使得超聲的空化作用和機械效應減弱，同樣造成膠原蛋白溶出速率減慢。此外，超聲作用對蛋白結構的改變會導致更多酶切位點的暴露，料液比為1∶15(g/mL)時，可能更有利于酶切位點的暴露。因此確定最佳料液比為1∶15(g/mL)，這與齊越等[16]研究結果的變化趨勢相符。

圖1 料液比對膠原蛋白提取率的影響Figure 1 Effects of the ratio of solid to liquid on extraction rate of collagen

2.2 超聲時間對膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲作用時間的增長，膠原蛋白提取率呈先升高后下降的趨勢，在25 min時達到最大值(83.69±0.51)%，與對照組(66.66±0.72)%相比，膠原蛋白的提取率有顯著提高(P<0.05)。在超聲25 min以內，隨著超聲時間的增加膠原蛋白的提取率呈現上升趨勢，這是因為超聲作用使得膠原纖維結構松散，促使膠原蛋白三螺旋主體部分溶于酸中而被提取出來[17-18]；隨著超聲時間的進一步增加，膠原蛋白的提取率逐漸下降，可能是長時間超聲處理所產生的熱效應和機械效應會破壞膠原蛋白結構，使部分膠原蛋白發生變性，在酸中的溶解度降低，提取率有所下降。綜上所述，確定較適超聲時間為25 min，這與楊萌萌等[19]研究結果的變化趨勢一致。

2.3 膠原蛋白的亞基組成

由圖3可知，對照組和超聲處理組提取的兔皮膠原蛋白都具有明顯的α1、α2和β組分[20]。在相對分子質量120 kDa附近的兩個條帶分別為α1和α2鏈，其中α1的強度明顯高于α2，說明膠原是由兩條α1和一條α2肽鏈構成，符合I型膠原蛋白的典型特征[21]，在α2鏈以下未發現其它電泳條帶，說明超聲處理制得的兔皮膠原蛋白純度較高，且未發生降解。SDS-PAGE 圖譜和膠原蛋白亞基組成證明短時超聲可以使膠原纖維底物得到松散，促使膠原分子溶于酸中，不會破壞膠原蛋白結構。

圖2 超聲處理時間對膠原蛋白提取率的影響Figure 2 Effects of ultrasonic time on extraction rate of collagen

M. 標準蛋白，1～6. 超聲時間分別為0,10,20,25,30,60 min

2.4 膠原蛋白的紫外光譜分析

膠原蛋白的近紫外吸收光譜可用于測量它的酪氨酸含量和非螺旋端肽的完整性。Lin等[22]報道的哺乳動物或魚類的I型膠原蛋白特征吸收光譜在218 nm處，這是由于肽鍵C═O的n→π*躍遷所致。圖4中對照組的最大吸收峰在219 nm處，超聲25 min的最大吸收峰在217 nm處，說明超聲處理后的膠原蛋白較好地保持了I型膠原蛋白的特征。此外，在280 nm處有微弱吸收，這可能與膠原蛋白中酪氨酸(278 nm)，苯丙氨酸(259 nm)的存在相關，正是這些吸收峰的存在說明膠原蛋白非螺旋端肽具有完整性。

2.5 膠原蛋白的紅外光譜分析

在紅外光譜中，酰胺鍵常被作為分析和鑒定蛋白質二級結構的特征官能團[23]。通常，酰胺A帶位于3 330～3 440 cm-1，主要與υN—H伸縮振動有關，由圖5和表1可知，對照組和超聲25 min的酰胺A帶吸收特征峰分別出現在3 434.99 cm-1和3 435.45 cm-1，酰胺A帶向高波數移動，說明分子中有氫鍵輕微破壞[24]；酰胺I帶位于1 636～1 661 cm-1，與C═O的伸縮振動和υN—H彎曲有關，膠原蛋白肽鏈間的氫鍵發生變化時，可由其吸收強度和波長位置的改變反映出來，吸收峰向高波數移動表明氫鍵被破壞，對照組和超聲25 min的酰胺I帶吸收特征峰分別出現在1 654.23 cm-1和1 657.22 cm-1，表明超聲處理制得的膠原蛋白分子中的氫鍵遭到部分破壞[23]；一般酰胺III帶的存在與膠原蛋白三螺旋結構的完整性有關[25]，且其吸收峰通常位于1 220～1 320 cm-1，對照組、超聲25 min的酰胺III帶的吸收特征峰分別出現在1 239.66 cm-1和1 239.99 cm-1，此外，若膠原蛋白的酰胺III峰與1 453 cm-1峰面積比為1.0時，則表明其具有完整的三螺旋結構[26]，對照組和超聲處理組膠原蛋白的酰胺III峰與1 453 cm-1峰面積比分別為1.063和1.042，說明經過超聲處理的膠原蛋白較好地保留了三螺旋結構。

圖4 超聲處理25 min制得的兔皮膠原蛋白的紫外光譜分析Figure 4 UV spectra of collagen from 25 min ultrasonic treatment

圖5 超聲處理25 min制得的兔皮膠原蛋白的紅外光譜分析Figure 5 FTIR spectra of collagen from 25 min ultrasonic treatment

表1 超聲處理25 min制得的兔皮膠原蛋白紅外光譜特征峰吸收波長Table 1 The absorbance positions of collagen from 25 min ultrasonic treatment

2.6 膠原蛋白的熱穩定性分析

由表2可知，超聲法制得的兔皮膠原蛋白的熱變性溫度和熱焓值均略低于傳統兔皮膠原。天然膠原蛋白是由三條肽鏈纏繞形成的一個三螺旋結構，當體系溫度達到熱變性溫度后，分子內氫鍵遭到破壞，分子結構從有序螺旋態變為無序態，維系膠原纖維結構穩定的分子間作用力越大，則其變性溫度和熱焓值越高[27]。超聲輔助提取的膠原蛋白熱變性溫度要稍低于對照組，可能是超聲處理會使維系膠原纖維之間的氫鍵遭到輕微破壞，使得變性溫度降低，這與紅外分析中的酰胺I帶結果一致。但總體來講本試驗超聲條件下提取的兔皮膠原蛋白較好地保持了天然結構，熱穩定性較高。

表2 超聲處理25 min制得的兔皮膠原蛋白的熱變性溫度及熱焓值表Table 2 The Tm and ΔH of collagen from 25 min ultrasonic treatment

3 結論

(1) 在超聲功率45%(總功率650 W)，頻率20 kHz，工作5 s間隔5 s，料液比1∶15(g/mL)，超聲時間25 min條件下輔助酶法提取兔皮膠原蛋白，其提取率比相同條件下常規酶解提高了25%，提取率達(83.69±0.51)%。

(2) 聚丙烯酰氨凝膠電泳結果表明，超聲處理制得的兔皮膠原蛋白主要由α1，α2和β亞基組成，為典型的I型膠原蛋白；紫外光譜表明，超聲制得的膠原蛋白的特征吸收波長為217 nm，較好地保持了I型膠原蛋白的特征；傅立葉變換紅外光譜表明，在本試驗超聲條件下，超聲波的空化和機械效應等只能使部分氫鍵輕微破壞，對膠原蛋白保持三螺旋結構的完整性沒有影響；差示掃描量熱儀結果表明，與傳統酶法提取的兔皮膠原蛋白相比，超聲輔助提取的兔皮膠原蛋白熱變性溫度和熱焓值略低，但總體而言仍具有較高的熱穩定性。

[1] 蔣挺大. 膠原與膠原蛋白[M]. 北京: 化學工業出版社, 2006: 3-45.

[2] BILEK S E, BAYRAM S K. Fruit juice drink production containing hydrolyzed collagen[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 14: 562-569.

[3] CHI H L, SINGLA A, LEE Y. Biomedical applications of collagen[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2001, 221(1/2): 1-22.

[4] 梅鑫東, 曾江南, 蔣柏泉. 酶法提取魚鱗膠原蛋白的工藝優化[J]. 食品與機械, 2014, 30(6): 156-159.

[5] 焦巖, 王振宇. 藍靛果花色苷超聲波輔助提取優化及其降血脂作用[J]. 中國食品學報, 2010, 10(2): 52-59.

[6] LI Hui, CHEN Bo, YAO Shou-zhuo. Application of ultrasonic technique for extracting chlorogenic acid fromEucommiaulmodiesOliv. (E.ulmodies)[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2005, 12(4): 295-300.

[7] 楊昱, 白靖文, 俞志剛. 超聲輔助提取技術在天然產物提取中的應用[J]. 食品與機械, 2011, 27(1): 170-174.

[8] RAN Xue-guang, WANG Lin-yue. Use of ultrasonic and pepsin treatment in tandem for collagen extraction from meat industry by-products[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2013, 94(3): 585-590.

[9] KYUNG K H, HO K Y, JI K Y, et al. Effects of ultrasonic treatment on collagen extraction from skins of the sea bassLateolabraxjaponicus[J]. Fisheries Science, 2012, 78(2): 485-490.

[10] 王雪蒙, 于瑋, 馬良, 等. 兔皮膠原蛋白的提取及其結構鑒定[J]. 食品與發酵工業, 2016(4): 209-213.

[11] 陳麗清. 超高壓技術制備高品質明膠及其機理研究[D]. 重慶: 西南大學, 2013: 22.

[12] 楊玲, 趙燕, 魯亮, 等. 鱘魚魚皮膠原蛋白的提取及其理化性能分析[J]. 食品科學, 2013, 34(23): 41-46.

[13] 于瑋, 王雪蒙, 馬良, 等. 豬皮膠原蛋白提取過程中酶解條件優化及其結構鑒定[J]. 西南大學學報: 自然科學版, 2015(4): 106-113.

[14] 周夢柔. 豬皮膠原蛋白明膠化過程中的微觀結構變化研究及明膠提取率預測模型的構建[D]. 重慶: 西南大學, 2014: 14.

[15] 吳倩, 張麗芬, 陳復生. 超聲波對蛋白質提取及改性影響的研究進展[J]. 食品與機械, 2015, 31(4): 256-259.

[16] 齊越. 超聲波輔助法酶解鹿皮膠原蛋白及其產品研發[D]. 吉林: 吉林大學, 2014: 21-30.

[17] KIM H K, KIM Y H, PARK H J, et al. Application of ultrasonic treatment to extraction of collagen from the skins of sea bassLateolabraxjaponicus[J]. Fisheries Science, 2013, 79(5): 849-856.

[18] LI De-fu, MU Chang-dao, CAI Su-mei, et al. Ultrasonic irradiation in the enzymatic extraction of collagen[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2009, 16(5): 605-609.

[19] 楊萌萌, 郭兆斌, 余群力, 等. 超聲波輔助法提取膠原蛋白工藝研究[J]. 甘肅農業大學學報, 2013, 48(3): 121-126.

[20] WANG Lin, LIANG Qiu-fang, CHEN Ting-ting, et al. Characterization of collagen from the skin of Amur sturgeon (Acipencserschrenckii)[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 38(38): 104 -109.

[21] NALINANON S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et al. Type I collagen from the skin of ornate threadfin bream (Nemipterushexodon): Characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 500-507.

[22] LIN Yung-kai, LIU Deng-cheng. Comparison of physical-chemical properties of type I collagen from different species[J]. Food Chemistry, 2006, 99(2): 244-251.

[23] MUYONGA J H, COLE C G B, DUODU K G. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch (Latesniloticus)[J]. Food Chemistry, 2004, 86(3): 325-332.

[24] DOYLE B B, BENDIT E G, BLOUT E R. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J]. Biopolymers, 1975, 14(5): 937-957.

[25] LIU Da-song, LIANG Li, REGENSTEIN J M, et al. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthysnobilis)[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1 441-1 448.

[26] SYLVESTER M F, YANNAS I V, SALZMAN E W, et al. Collagen banded fibril structure and the collagen-platelet reaction[J]. Thrombosis Research, 1989, 55(1): 135-148.

[27] 康俊霞, 康永鋒, 包斌, 等. Na+、Ca2+和pH值對鯨鯊皮膠原蛋白熱變性溫度的影響[J]. 食品科學, 2011(13): 66-70.

Ultrasonic-assisted extraction and physicochemical characteristics of collagen from rabbit-skin

ZHANG Xiao-jie1ZHANGYu-hao1MALiang2MAMing-si2ZHENGHong2SUNYi2

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.NationalFoodScienceandEngineeringExperimentalTeachingCenter,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

The application of ultrasonic irradiation to extract pepsin-soluble collagen from the skins of rabbit was investigated in this study. The results showed that the extraction rate of collagen using the ultrasonic irradiation was (83.69±0.51) % and the yield increased by 25% in comparison with the conventional pepsin isolation method. The result of polyacrylamide gel electrophoresis confirmed that the subunits structure of collagen using the ultrasonic irradiation was mainly ofα1,α2andβ, without subunit degradation. Moreover, the ultraviolet spectrum exhibited a typical absorption peak at 217 nm, indicating that it greatly maintained the characteristics of type I collagen. Additionally, the Fourier transform infrared spectroscopy revealed that hydrogen bond was partially destroyed, but the triple helix structure of collagen remained intact even after the ultrasonic irradiation. However, the result of Scanning Differential Calorimeter analyses showed that the thermal denaturation temperature and enthalpy value of collagen using the ultrasonic irradiation were slightly lower than that of the traditional rabbit collagen, and it still had a relatively higher thermal stability.

rabbit skin; collagen; ultrasonic; physicochemical characteristic

國家自然科學基金項目(編號：31301425)；中央高校基本科研業務費重大項目(編號：XDJK2015A015)；中國博士后科學基金面上項目(編號：2014M562267)；中國博士后科學基金特別資助項目(編號：2015T80951)；重慶市基礎科學與前沿技術研究重點項目(編號：cstc2015jcyjBX0116)；第四批重慶市高等學校優秀人才支持計劃

張曉潔，女，西南大學在讀碩士研究生。

張宇昊(1978—)，男，西南大學教授，博士。 E-mail:Zhy1203@163.com

2016—10—28

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.038