藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質(zhì)的提取及體外抗氧化活性研究

王春霞 蒲 彪 蔣 燕 付本寧

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川省宜賓市食品藥品檢驗檢測中心，四川 宜賓 644000)

藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質(zhì)的提取及體外抗氧化活性研究

王春霞1蒲 彪1蔣 燕2付本寧1

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川省宜賓市食品藥品檢驗檢測中心，四川 宜賓 644000)

采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質(zhì)的微波輔助提取工藝，并對黃酮類提取物進(jìn)行體外抗氧化活性測定。研究結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：微波功率506 W，微波處理時間256 s，乙醇濃度75%，液料比50∶1(mL/g)，所得餅粕黃酮得率(以蘆丁計)為(0.40±0.04)%。藤椒冷榨油餅粕黃酮的還原力、自由基清除能力隨其質(zhì)量濃度增加而總體呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，0.05 mg/mL餅粕黃酮的還原力和0.03 mg/mL的抗壞血酸溶液還原力相當(dāng)；餅粕黃酮、抗壞血酸對·OH的IC50值分別為0.074，0.053 mg/mL；對DPPH·的IC50值為0.024，0.016 mg/mL。研究結(jié)果證明餅粕黃酮具有較高的體外抗氧化活性，具備天然抗氧化劑開發(fā)價值。

藤椒；冷榨油；餅粕；微波輔助提取；黃酮；抗氧化活性

藤椒，學(xué)名竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.Prodr.)，是蕓香科花椒屬的一個優(yōu)良品種代表[1]。藤椒具有消費(fèi)者更易接受的濃郁香氣及麻味稍淡的口感，因而被直接用于川菜調(diào)味。但和傳統(tǒng)紅花椒不同，藤椒干制易發(fā)生褐變，且香麻味及營養(yǎng)物質(zhì)也會有所損失，而藤椒油麻香味濃郁、口感更加豐滿，因此藤椒油是藤椒的主要食用方式之一[2-3]。

目前，中國藤椒制油工業(yè)已廣泛采用冷榨制油工藝。因為冷榨制油工藝采用低溫物理機(jī)械壓榨，與傳統(tǒng)制油工藝相比，可避免高溫造成油脂結(jié)構(gòu)向反式脂肪酸、油脂聚合體等有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變，也可降低重金屬、酸、堿等有害物質(zhì)殘留，最大限度地保留活性成分，從而提高油的品質(zhì)[4]。在冷榨制油過程中，冷榨油餅粕是主要副產(chǎn)物，已有的研究證明冷榨油餅粕中多含有高利用價值的物質(zhì)，如琉璃苣冷榨油餅粕中提取的多酚具有較好的DPPH·清除能力[5]，菜籽冷榨油餅粕替代傳統(tǒng)蛋白飼料，可顯著降低雄性閹豬對于飼料中粗蛋白的回腸表現(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)回腸消化率[6]，葡萄籽冷榨餅粕超微粉對衰老小鼠內(nèi)臟具有抗氧化、抗衰老作用[7]等。目前對于藤椒冷榨油餅粕的報道較少，僅有姜?dú)g笑[8]研究了其基本成分，并采用不同方法提取了藤椒冷榨油餅粕中的油脂及蛋白質(zhì)。黃酮類物質(zhì)是從天然原料中篩選出來的具有較強(qiáng)抗氧化活性的天然產(chǎn)物之一，已成為食品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9]。研究表明，花椒屬植物含有豐富的黃酮類物質(zhì)[10]，且黃酮類物質(zhì)是花椒果皮抗氧化活性的主要功能成分[11]。在藤椒黃酮物質(zhì)的研究方面，羅雅杰等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)藤椒中黃酮(蘆丁)含量為(23.03±0.18) mg/g，且具有較好的體外抗氧化活性，可望開發(fā)為新一代的天然抗氧化劑。

近年在四川境內(nèi)，洪雅、三臺、廣安等地已建立多個藤椒種植基地，藤椒產(chǎn)量不斷提高，藤椒制油后副產(chǎn)物的綜合利用問題亟待解決，對其冷榨餅粕中活性物質(zhì)進(jìn)行提取、性質(zhì)鑒定等，是藤椒制油后副產(chǎn)物開發(fā)利用的研究基礎(chǔ)。

微波輔助提取因具有穿透力強(qiáng)、對目標(biāo)成分進(jìn)行選擇性快速提取等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的提取中[14-15]。綜合上述研究現(xiàn)狀，本研究提出以藤椒冷榨油餅粕為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取餅粕中黃酮類物質(zhì)的條件，并對餅粕中黃酮類物質(zhì)的體外抗氧化活性進(jìn)行初步分析，旨在為藤椒冷榨油餅粕中的黃酮類物質(zhì)提取、利用提供一定理論基礎(chǔ)，為天然抗氧化劑的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)價廉的原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤椒冷榨油餅粕：洪雅幺麻子藤椒油食品有限公司，55℃ 鼓風(fēng)干燥后粉碎至60目并經(jīng)石油醚脫脂后備用；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：純度≥98%，美國 Sigma 公司；

蘆丁：純度≥98%，天津一方生物科技有限公司；

無水乙醇、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯酸、三氯化鐵、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、水楊酸等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

微波科學(xué)實(shí)驗爐：ORW08S-3H型，南京澳潤微波科技有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW-100型，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-3100型，上海美普達(dá)儀器有限公司；

電子天平：CP225D型，德國Sartorius股份公司；

臺式離心機(jī)：Thermo MULTIFUGE X3R型，美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁顯色法[16]。準(zhǔn)確稱取121℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以60%乙醇為溶劑，配制成濃度為1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，梯度稀釋成蘆丁濃度為0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL，取1 mL不同濃度樣品于10.0 mL容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉0.30 mL，混勻后放置6 min，加10%的硝酸鋁0.3 mL，混勻后放置6 min，加入4%的氫氧化鈉4.0 mL，最后用60%乙醇定容，放置15 min。測定各溶液在510 nm波長下的吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)x，以吸光度為縱坐標(biāo)y，擬合所得線性回歸方程為y=12.332x-0.000 11，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，蘆丁濃度線性范圍0.00～0.06 mg/mL。

1.3.2 藤椒冷榨油餅粕黃酮類物質(zhì)的微波輔助提取工藝及工藝條件優(yōu)化 稱取5.0 g處理好的餅粕，按設(shè)定的液料比加入設(shè)定濃度的乙醇溶液，經(jīng)設(shè)定的微波條件處理后，抽濾，濾液在常溫下3 000 r/min離心10 min，以提取劑定容，測定黃酮濃度，結(jié)合1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程和式(1)計算從藤椒冷榨油餅粕中提取出的黃酮得率(以蘆丁含量計)，并以此作為提取工藝的評價指標(biāo)。

(1)

式中：

Y——黃酮得率，%；

c——提取液總黃酮濃度，mg/mL；

v——提取液定容體積，mL；

m——餅粕質(zhì)量，g。

(1) 單因素試驗設(shè)計：參照文獻(xiàn)[17～18]設(shè)定提取條件，分別考察液料比 [30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1(mL/g)]，微波處理時間(60，120，180，240，300 s)，乙醇濃度(50%，60%，70%，80%，90%)，微波功率(300，400，500，600，700 W) 4個因素對餅粕中黃酮得率的影響。考察某一單因素時，僅改變該單因素條件，其他因素固定條件。考察時，各因素的固定條件分別為：液料比30∶1(mL/g)、微波處理時間120 s、乙醇濃度60%，微波功率400 W。

(2) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhken試驗設(shè)計原理，以黃酮得率為響應(yīng)值，對料液比、微波處理時間、乙醇濃度、微波功率4個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

1.3.3 藤椒冷榨油餅粕黃酮類物質(zhì)的體外抗氧化活性測定

(1) 樣品溶液制備：將餅粕黃酮提取物按倍比稀釋法配置成一系列濃度(以蘆丁計)：0.010，0.015，0.020，0.025，0.030，0.035，0.040，0.045，0.050 mg/mL，做體外抗氧化活性分析。同時配置相同濃度梯度的抗壞血酸溶液做陽性對照。

(2) 總還原力測定：參考張宇思等[19-20]的方法，略作調(diào)整。分別加入不同濃度的樣品溶液2 mL、0.2 mo1/L pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混勻后放入50℃水浴保溫20 min，快速冷卻，加入10%的三氯乙酸2.0 mL，充分混勻，在低速離心機(jī)中，3 000 r/min離心10 min。取離心樣液的上清液2.5 mL并過濾膜，加蒸餾水2.5 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL，充分混勻，靜置10 min 后在700 nm處測定吸光度。

(3) 清除羥自由基(·OH )能力測定：在試管中分別依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，不同梯度濃度的樣品溶液1 mL，8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL，搖勻，靜置10 min 后加入9 mmol/L的水楊酸—乙醇溶液1 mL，搖勻，37℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，于510 nm處測其吸光值A(chǔ)x。以樣品溶劑代替樣品溶液做反應(yīng)體系本底吸收值A(chǔ)0，考慮到樣品本身的吸光值影響，以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品的本底吸收值A(chǔ)x0[21]。按式(2)計算清除率。

(4) 清除DPPH·能力測定：分別在10 mL的試管中加入0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL，不同濃度的樣品溶液2 mL，混勻后，避光靜置30 min，于517 nm處測吸光值A(chǔ)x，以無水乙醇代替 DPPH·溶液做樣品本底吸收Ax0，以樣品溶劑替代樣品溶液做DPPH·本底吸收A0[21]。同時以抗壞血酸做陽性對照。按式(2)計算清除率。

(2)

式中：

D——自由基清除率，%；

Ax——反應(yīng)體系吸光度；

Ax0——樣品本底吸光度；

A0——反應(yīng)體系本底吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

單因素試驗結(jié)果及體外抗氧化活性IC50值計算采用 Origin 8.5.1 軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗結(jié)果采用Design-Expert.8.05b軟件進(jìn)行分析。每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質(zhì)提取單因素試驗結(jié)果

微波輔助提取工藝單因素試驗結(jié)果見圖1。由圖1(a)可知，隨著液料比的增加，餅粕黃酮的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，液料比50∶1(mL/g)時得率最大，繼續(xù)增加液料比，得率反而下降，原因可能是：在液料比增大的同時固液兩相的濃度差也在增大，使得黃酮從細(xì)胞內(nèi)往外擴(kuò)散的速率和溶解量相應(yīng)增大，得率升高，液料比持續(xù)增加，餅粕中其他活性物質(zhì)如多糖溶出從而影響黃酮的提取[17]。為避免引入雜質(zhì)，節(jié)約溶劑成本，選擇50∶1(mL/g)為最佳液料比。

由圖1(b)可知，在60～240 s時，隨著微波處理時間的延長，溶出的黃酮物質(zhì)質(zhì)量增多，得率上升，說明微波處理有助于餅粕中黃酮物質(zhì)的提取；超過240 s以后得率開始下降，有可能是長時間微波處理，輻射作用和產(chǎn)生的局部高溫導(dǎo)致黃酮類產(chǎn)物發(fā)生氧化，活性成分結(jié)構(gòu)被破壞[22]，導(dǎo)致得率下降。同時從節(jié)約能源方面考慮，選擇最優(yōu)微波處理時間為240 s，可能是原料不同的原因，相較焦士蓉等[23]采用微波提取黃酮時間長。

由圖1(c)可知，乙醇濃度為50%～70%時，餅粕黃酮得率逐漸上升，70%的乙醇對應(yīng)得率最高，可能是70%的乙醇同藤椒冷榨油餅粕中的黃酮類物質(zhì)極性相近[17]，而高濃度乙醇可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，使得黃酮類物質(zhì)溶出受阻[24]，故最適宜的乙醇濃度為70%，與劉軍海[25]的研究結(jié)果一致。

由圖1(d)可知，在300～500 W時，得率隨微波功率的增大而不斷上升，500 W以后，微波功率繼續(xù)增大，黃酮得率反而下降，可能是大功率產(chǎn)生的局部過熱使得目標(biāo)產(chǎn)物黃酮類物質(zhì)被破壞，故選擇500 W為最佳微波功率，這與He等[26]所得最優(yōu)功率條件一致。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以黃酮得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗考察微波處理時間、微波功率、乙醇濃度、液料比對餅粕黃酮得率的影響，因素水平見表1，試驗方案及結(jié)果見表2。

圖1 微波處理工藝各因素對餅粕黃酮的提取效果影響Figure 1 Effect of different factors of microwave-tratement on the yield of flavonoids from cold pressed oil cake

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析 運(yùn)用Design-Expert.8.05b數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)多元回歸擬合得到二次回歸方程為：

Y=0.40+0.017A+0.010B+0.019C+0.005D-0.001AB+0.009AC+0.011AD-0.007BC-0.018BD-0.004CD-0.04A2-0.046B2-0.022C2-0.053D2。

(3)

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

由表3還可知，除因素D和交互因素AC為顯著外，模型的一次項和二次項及交互因素AD、BD對響應(yīng)值的影響均為極顯著；影響餅粕黃酮得率的各因素主次因素排序依次為C>A>B>D。模型的交互因素AB、BC、CD對響應(yīng)值的影響不顯著，剔除不顯著項后可將模型簡化為：

Y=0.40+0.017A+0.010B+0.019C+0.005D+0.009AC+0.011AD-0.018BD-0.04A2-0.046B2-0.022C2-0.053D2。

(4)

由回歸分析可知，AC、AD、BD因子交互作用對黃酮得率的影響顯著，圖2～4給出了影響因素交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線圖。由圖2～4可以看出，在試驗所選范圍內(nèi)，響應(yīng)曲面較為陡峭，響應(yīng)值是存在極值的，且兩因素間互作的等高線圖呈橢圓，再次說明互作是顯著的[27]。

2.2.2 驗證實(shí)驗 通過回歸模型對微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化所得最佳提取工藝為：微波時間256.27 s、微波功率506.2 W、乙醇濃度74.83%、液料比50.5∶1(mL/g)，在此參數(shù)下，模型預(yù)測黃酮得率為0.40%。為方便進(jìn)行試驗，將最優(yōu)條件調(diào)整為：微波時間256 s，微波功率506 W，乙醇濃度75%，液料比50∶1(mL/g)，此條件下進(jìn)行5次驗證實(shí)驗，所得黃酮得率為(0.40±0.04)%，與預(yù)測值基本一致，說明該模型能較好地預(yù)測微波輔助提取餅粕中黃酮類物質(zhì)的得率。

表3 方差分析表?Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖2 乙醇濃度和微波處理時間對黃酮得率的影響Figure 2 Influences of ethanol concentration and microwave treatment time on the extraction yield of cold pressed oil cake flavonoids

圖3 液料比和微波處理時間對黃酮得率的影響Figure 3 Influences of liquid-material ratio and microwave treatment time on the extraction yield of cold pressed oil cake flavonoids

圖4 液料比和微波功率對黃酮得率的影響Figure 4 Influences of liquid-material ratio and microwave power on the extraction yield of cold pressed oil cake flavonoids

2.3 體外抗氧化活性測定結(jié)果

較體內(nèi)抗氧化活性測定而言，體外抗氧化活性測定因具有簡單、方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[28]。采用典型的體外抗氧化模型，以總還原力、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力為指標(biāo)考察餅粕黃酮的體外抗氧化活性。

2.3.1 總還原能力 物質(zhì)的還原能力與抗氧化活性之間存在十分密切的關(guān)系，還原力強(qiáng)，表示其具有強(qiáng)的抗氧化性[29]。由圖5可知，在0.01～0.05 mg/mL時，餅粕黃酮提取物、抗壞血酸均在較低質(zhì)量濃度下有較高的還原力，且還原力均是隨質(zhì)量濃度的增大而增大。餅粕黃酮的還原力雖不及相同濃度的抗壞血酸，但0.05 mg/mL餅粕黃酮的還原力與0.03 mg/mL抗壞血酸相當(dāng)，說明餅粕黃酮是具有還原力的。此外，餅粕黃酮還原力大小與其質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)R2為0.983 4，藤椒冷榨油餅粕提取物的還原力和黃酮含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.3.2 清除·OH能力 由圖6可知，在0.01～0.05 mg/mL時，樣品溶液對·OH的清除率隨濃度的增加逐漸升高，清除效果與濃度呈一定的正相關(guān)，兩種樣品最大清除率分別為24.95%，40.11%，餅粕黃酮對·OH的清除能力約為抗壞血酸的62.2%，經(jīng)計算，餅粕黃酮、抗壞血酸的IC50值分別為0.074，0.053 mg/mL，表明餅粕黃酮提取物對·OH具有一定的清除作用。

圖5 樣品總還原力測定Figure 5 The result of total reducing power

圖6 樣品對·OH的清除效果Figure 6 The result of hydroxyl free radical scavenging rate

2.3.3 清除DPPH·能力 由圖7可知，在0.01～0.05 mg/mL時，樣品溶液對DPPH·的清除率隨濃度的增加逐漸升高，且在較低濃度時即可達(dá)到90%以上的清除率。餅粕黃酮IC50值為0.024 mg/mL，抗壞血酸的IC50值則為0.016 mg/mL。雖然餅粕黃酮的IC50值高于牛欣欣等[30]試驗中紅花椒提取物的IC50值(0.013 8 mg/mL)，但仍表明餅粕黃酮提取物具有較高的清除DPPH·能力，進(jìn)一步證明餅粕黃酮提取物具有較高的體外抗氧化活性。

圖7 樣品對DPPH·的清除效果Figure 7 The result of DPPH free radicals scavenging rate

3 結(jié)論

(1) 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化擬合得到的二次回歸方程能較好地預(yù)測藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質(zhì)的得率。優(yōu)化所得微波輔助提取黃酮的最佳工藝為：微波功率506 W，微波處理時間256 s，乙醇濃度75%，液料比50∶1(mL/g)，在此條件下，藤椒冷榨油餅粕黃酮得率(0.40±0.04)%，約為羅雅杰等[13]測得藤椒黃酮得率的17.37%，說明藤椒冷榨油餅粕中殘留的黃酮類物質(zhì)較多。

(2) 藤椒冷榨油餅粕黃酮的體外抗氧化活性隨著黃酮提取物質(zhì)量濃度增加而總體呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢。0.05 mg/mL餅粕黃酮的還原力和0.03 mg/mL抗壞血酸的還原力相當(dāng)。餅粕黃酮對羥自由基和DPPH自由基的IC50值分別為0.074，0.024 mg/mL，餅粕中的黃酮類物質(zhì)對羥自由基的清除能力弱于對DPPH自由基的清除能力。

(3) 從藤椒冷榨油餅粕中所提取的黃酮類物質(zhì)在試驗中表現(xiàn)出了較好的體外抗氧化活性，下一步可對其進(jìn)行分離純化分析測定，以獲得具有明確抗氧化作用的組分，并與未經(jīng)冷榨處理的藤椒果實(shí)中黃酮類物質(zhì)做對比，為藤椒冷榨油餅粕的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

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Extraction and antioxidant activity in vitro of flavonoids in cold pressed cake ofZanthoxylumarmatumDC.Prodr.

WANG Chun-xia1PUBiao1JIANGYan2FUBen-ning1

(1.SichuanAgriculturalUniversityCollegeofFoodScience,Ya’an,Sichuan625014,China; 2.FoodandDrugInspectionandTestingCenterinYibin,Yibin,Sichuan644000,China)

Response surface methodology was used to optimize the microwave- assisted extraction of flavonoids from cold pressed cake inZanthoxylumarmatumDC.Prodr， and the antioxidant activity in vitro of flavonoids were analyzed. The results showed that the optimum extraction process of flavonoids were： microwave power 506 W, microwave treatment time 256 seconds, ethanol concentration 75%, ratio of liquid to material 50∶1. Under this condition, extraction ratio of flavonoids was 0.40%±0.04% ( in terms of rutin). The reducing power, the hydroxyl free radicals, DPPH free radicals, scavenging capacity of flavonoid extracts were increased gradually with the increasing of the mass concentration, and the reducing power of 0.05 mg/mL flavonoids from cold pressed cake was equal with 0.03 mg/mL VC; the half inhibition concentration of hydroxyl free radical scavenging rate of flavonoids from cold pressed cake and VCwere 0.074, 0.053 mg/mL while the half inhibition concentration of DPPH free radical scavenging rate were 0.024, 0.016 mg/mL. The flavonoids from cold pressed cake had a certain antioxidant activity in vitro, and had the value of developing into natural antioxidants.

ZanthoxylumarmatumDC.Prodr.; cold pressed oil; cake; microwave-assisted extraction; flavonoids; antioxidant activity

國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(編號：201304703)；國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：31171726)

王春霞，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

蒲彪 (1956—)，男，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。 E-mail:pubiao2002@163.com

2016-11-03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.032