巴氏殺菌雞蛋清液磷酸化改性及性質研究

張根生 李婷婷 丁 健 常 虹

王 芮 池天奇 唐 敏

(哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

巴氏殺菌雞蛋清液磷酸化改性及性質研究

張根生 李婷婷 丁 健 常 虹

王 芮 池天奇 唐 敏

(哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

以巴氏殺菌雞蛋清為原料，利用三聚磷酸鈉(STP)對雞蛋清液進行磷酸化改性。通過單因素和正交試驗確定了磷酸化最佳工藝條件，即反應pH 7.5，STP添加量4%，反應溫度40℃，反應時間4 h，該條件下磷酸化程度為50.96 mg/g，并利用低場核磁共振(LF-NMR)輔助觀察了反應過程中蛋白質與水分的結合情況。結果表明，雞蛋清液經過磷酸化改性后，其溶解性、持水性、起泡性、乳化性均得到了改善。

雞蛋清；巴氏殺菌；三聚磷酸鈉；磷酸化程度；低場核磁共振

雞蛋是人類理想的天然食品之一[1]，含有高生物價值的蛋白質以及大量的維生素及礦物質，營養成分均衡，是良好的蛋白質來源。將雞蛋加工成液態蛋后，具有安全、易于儲存和運輸的特點，因此在食品工業中被廣泛應用[2]。而蛋清液作為雞蛋中主要的功能性物質來源，具有良好的溶解性、持水性、起泡性等性質，能有效改善食品的品質和質構[3]，是重要的食品加工原料。

蛋清的功能特性與其蛋白的化學組成和各成分比例有關[4]。蛋清的改性就是在不影響其營養價值的基礎上，利用物理或生化手段改變其蛋白質的空間構象，從而引起其功能性質發生改變[5-6]。磷酸化改性作為蛋白質化學改性的一種，已被認定為改善蛋白質功能性質的有效改性方法，改性后的蛋白質等電點發生遷移，同時溶解性明顯提高[7-8]。因此許多國內外學者致力于蛋白質磷酸化改性的研究，Matheis[9]研究了多聚磷酸鈉用量、改性溫度及pH值對大豆蛋白磷酸化的影響，發現反應與改性條件關系密切。李瑜[10]對小麥面筋蛋白進行多聚磷酸鈉改性，改性后的蛋白可以很好地應用于烘焙食品中。劉麗莉等[11]對雞蛋清蛋白磷酸化改性及改性后功能性質的變化進行了研究，該試驗將雞蛋清噴霧干燥制成蛋清粉后進行磷酸化改性，改性后各項功能性質均得到提高。

近年來，低場核磁共振技術(LF-NMR)被廣泛應用于生物體系中水分遷移變化的研究[12]，LF-NMR是根據弛豫時間的改變從而反映出水分分布情況的變化，達到區分自由水和結合水的目的。而利用LF-NMR觀察分析禽蛋及其制品內部水分遷移情況的研究較少，劉斯琪等[13]利用LF-NMR技術研究了食鹽對鴨蛋黃品質的影響，研究表明食鹽會改變鴨蛋黃內部氫質子的分布情況，使其質構及出油率發生改變，從而影響鴨蛋黃的品質。利用LF-NMR研究雞蛋清液磷酸化改性前后水分遷移情況尚未見報道。

本試驗擬利用三聚磷酸鈉(STP)直接對雞蛋清液進行磷酸化改性，并采用LF-NMR技術輔助分析蛋清液改性前后的功能性，旨在為進一步提高蛋清液的加工特性以及其在食品中的應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮雞蛋：市售，表面潔凈無裂紋，內部蛋黃完整，蛋白澄清透明、無異味，無其他組織異物；

三聚磷酸鈉(STP)：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋：DK-98-1型，天津市泰斯特儀器有限公司；

集熱式恒溫磁力攪拌器：CL-200型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

臺式高速離心機：TG16-WS型，湘南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

酸度計：PB-10型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

可見分光光度計：V-5000型，上海元析儀器有限公司；

凱氏定氮儀：KDY-9820型，北京市通潤源機電技術有限責任公司；

低場核磁共振分析儀：NM-120型，上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巴氏殺菌蛋清液的制備 利用分離器分離鮮雞蛋的蛋清與蛋黃，于磁力攪拌器上以30 r/s攪拌25 min，靜置1 h后棄除底層臍帶等雜質。將除雜后的蛋清液在59.5℃下殺菌4.5 min[2]，于4℃下冷藏備用。

1.3.2 成分含量的測定

(1) 水分含量：按GB/T 5009.3—2003執行。

(2) 蛋白質含量：按GB/T 5009.5—2003執行。

1.3.3 磷酸化程度的測定 參考文獻[14]，略作修改，分別取磷酸化反應前后的溶液5 mL，加入5 mL的10%三氯乙酸(TCA)使蛋白變性沉淀，用離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液加入1 mol/L的乙酸鋅Zn(Ac)2，使溶液pH至3.8～3.9(用乙酸鋅調節)，形成沉淀后加入氨緩沖液使沉淀溶解，并以鉻黑T為指示劑，用0.1 mol/L EDTA標準溶液進行滴定，溶液顏色由紫紅變為藍色時即為滴定終點，磷酸化程度按式(1)計算：

(1)

式中：

ME——磷酸化程度，mg/g；

C——EDTA標準溶液濃度，mol/L；

V1——滴定樣品所耗標準溶液體積，mL；

V2——滴定空白所耗標準溶液體積，mL；

Mp——磷的摩爾質量，30.97 g/mol；

M——樣品中蛋白質質量，g。

1.3.4 蛋清蛋白磷酸化功能性的研究

(1) 溶解性的測定：參考文獻[15]33，略作修改，稱取一定量的改性前后雞蛋清液，配制成質量濃度為1.0 g/100 mL的蛋白質溶液，分別調節pH值在2～11，置于磁力攪拌器上中速攪拌0.5 h，靜置30 min后3 500 r/min離心15 min，收集上清液，凱氏定氮法測定上清液中蛋白質的含量，溶解度(NSI)按式(2)計算：

(2)

(2) 持水性的測定：參考文獻[16]，略作修改，將改性前后的雞蛋清液真空冷凍干燥制成蛋清粉。準確稱取1.00 g樣品于離心管中并稱重，記為W1。加入30 mL蒸餾水后攪拌均勻，并分別調節樣液的pH至2～11。將裝有樣品的離心管于60℃下水浴30 min，然后3 000 r/min離心10 min，去除上層清液后稱重，記為W2，持水性按式(3)計算：

(3)

式中：

WHC——持水性，g/g；

W——樣品質量，g；

W1——樣品和離心管總重量，g；

W2——沉淀和離心管總重量，g。

(3) 蛋白起泡性的測定：參考文獻[17]，略作修改，將改性前后的雞蛋清溶液配置成蛋白濃度為1%的溶液，分別調節pH值至2～11，用高剪切分散乳化機10 000 r/min剪切1 min，然后迅速將泡沫及溶液轉移到250 mL量筒中，讀取泡沫層的體積V1。靜置30 min后，讀取殘留泡沫體積記為V2，泡沫穩定性按式(4)計算：

(4)

式中：

FS——泡沫穩定性，%；

V1——泡沫層的體積，mL；

V2——殘留泡沫，mL。

(4) 乳化性測定：參考文獻[18]，略作修改。稱取3 g冷凍干燥后的樣品于燒杯中，加入50 mL蒸餾水并調節pH為8.0，加入50 mL花生油，用高速組織搗碎機10 000 r/min攪拌2 min，然后2 000 r/min離心4 min。取出離心管，測定其乳化層高度及液體總高度，乳化性按式(5)計算：

(5)

式中：

EA——乳化性，%；

H1——離心管中乳化層高度，cm；

H2——離心管中液體總高度，cm。

(5) 乳化穩定性測定：參考文獻[19]，略作修改，稱取3 g冷凍干燥后的樣品于燒杯中，加入50 mL蒸餾水并調節pH為8.0，加入50 mL花生油，用高速組織搗碎機10 000 r/min攪拌2 min，然后于50℃下水浴30 min，取出離心管，測定其乳化層高度，乳化穩定性按式(6)計算：

(6)

式中：

ES——乳化穩定性，%；

H1——水浴后乳化層高度，cm；

H2——樣品原始乳化層高度，cm。

1.3.5 蛋白質低場核磁共振分析 低場核磁共振指標測定，硬脈沖CPMG序列各項參數：P1=14，P2=28，TW=4 000，DRG=3，SW=200，DFW=30.0，SF1=18，O1=430 811.1，RG1=20，NS=4，TE=0.4，NECH=13 000。

1.3.6 單因素試驗設計

(1) STP添加量：稱取適量樣品，調節其pH值至8，分別向溶液中加入1%，2%，3%，4%，5%的STP，調節其反應溫度為40℃，使其反應4 h。反應結束后，以磷酸化程度為指標，確定出蛋清液磷酸化的STP最佳添加量。

(2) 反應溫度：稱取適量樣品，調節其pH值至8，向溶液中加入4%的STP，分別調節其反應溫度至25，30，35，40，45，50，55℃，使其反應4 h。反應結束后，以磷酸化程度為指標，確定出蛋清液磷酸化的最佳反應溫度。

(3) 反應時間：稱取適量樣品，調節其pH值至8，向溶液中加入4%的STP，調節其反應溫度為40℃，分別使其反應1，2，3，4，5 h。反應結束后，以磷酸化程度為指標，確定出蛋清液磷酸化的最佳反應時間。

(4) 反應pH：稱取適量樣品，分別調節其pH值為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，向溶液中加入4%的STP，調節其反應溫度為40℃，使其反應4 h。反應結束后，以磷酸化程度為指標，確定出蛋清液磷酸化的最佳反應pH。

1.3.7 正交試驗方案 通過單因素試驗的確定，選用L9(34) 正交表進行優化試驗，平行試驗3次。

1.4 數據統計分析方法

試驗數據采用Excel和Spss 21.0進行分析。

2 結果與討論

2.1 正交試驗結果

正交試驗各因素水平見表1，試驗方案及結果見表2。由表2可知，影響磷酸化程度的各因素主次順序為D>A>B>C，確定的最優水平為D1A2B3C2，即反應pH 7.5，STP添加量4%，反應溫度40℃，反應時間4 h。對理論最優方案進行多組平行驗證實驗，結果表明，在該方案下蛋清液的磷酸化程度為50.96 mg/g，達到最大值，因此此方案為最優方案。

2.2 蛋清液磷酸化功能性分析

2.2.1 蛋清液磷酸化對其溶解性及持水性的影響 由圖1可知，從整體趨勢來看，磷酸化改性后雞蛋清蛋白的溶解性大于未改性前。pH在2～3及5～11時，改性后的蛋白溶解度大于改性前，這為一些酸性食品的開發生產提供了依據。未改性時蛋清蛋白等電點(pI)在pH 5左右[20]，而磷酸化改性會使其等電點發生遷移，即改性后蛋白等電點在pH 4左右，此時蛋白的溶解度小于改性前，這是因為在等電點附近，蛋白所帶的凈電荷減少，水化作用減弱，使溶解性下降；當pH>4時，介質的pH大于蛋白質的等電點，導致蛋白表面的電荷分布情況發生改變，同時磷酸基團的引入使蛋白質體系的電負性增強，分子間的靜電斥力增大，蛋白質結構更加松散，更易分散于水中，使改性后的溶解度明顯提高。

表1 正交試驗各因素水平范圍表Table 1 Range of each factor in orthogonal test

表2 正交試驗方案及試驗結果Table 2 Orthogonal test programs and test results

由圖2可知，當pH=4時，改性后的蛋白持水性低于改性前，是因為此處接近改性后蛋白等電點，蛋白質分子間靜電斥力減小而吸引力增大，導致其大部分極性基團參與蛋白與蛋白之間的相互作用，無法與水結合，這時蛋白之間的吸引力使蛋白質分子結合更緊密，分子間的孔隙減少，水分子不易向蛋白分子內部擴散，導致持水性降低，同理，當pH=6時，此處接近未改性的蛋清蛋白等電點，導致其持水性小于改性后。而當pH>6時，改性前后的蛋清蛋白持水性均呈上升趨勢，這是因為pH的增大使蛋白質所帶電量增加，分子間的斥力增大使蛋白質解聚，形成持水的空間網絡結構，因此持水性變大[21]。

圖1 磷酸化改性對蛋清蛋白溶解性的影響Figure 1 The effect of phosphorylation on the solubility of egg white

圖2 磷酸化改性對蛋清蛋白持水性的影響Figure 2 The effect of phosphorylation on the water holding capacity of egg white

2.2.2 蛋清液磷酸化對其起泡性的影響 由圖3可知，從整體上看，隨著pH的增大，改性后雞蛋清液的起泡性大于改性前。雞蛋清液的起泡性與其溶解性有關，未改性的蛋白等電點在pH 5左右，而改性后的蛋白等電點在pH 4左右，此時兩者的溶解度較低，因此溶液較粘稠且流動性差，不易形成液膜包裹空氣，同時由于蛋白質在等電點區域易凝結，因此兩者的起泡性均為最低值。當58時，改性后的蛋白起泡性呈下降趨勢。

由圖4可知，磷酸化改性后的泡沫穩定性有所提高。泡沫穩定性由液膜強度決定，改性后蛋清蛋白表面吸附膜的粘度和彈性增加，膜強度變大，使泡沫穩定性增強，因此改性后泡沫穩定性高于改性前。雖然在pH=4時，改性后的蛋清蛋白起泡性最低，但其泡沫穩定性較好，這是因為形成的泡沫在等電點區域內破裂速度較慢，泡沫排液速率也有所減緩，從而使得泡沫穩定[15]36。

2.2.3 蛋清液磷酸化對其乳化性的影響 由圖5可知，磷酸化改性后，蛋清蛋白的乳化性及乳化穩定性均有所提高。這是因為改性使蛋白分子間的斥力增大，使其疏水基團暴露，蛋白質的親油性提高，同時負電荷的引入大大降低了乳化液的表面張力[11]，促進了乳狀液滴的形成，且相互之間彼此分散，有利于蛋白質在乳化過程中在油—水界面擴散和重排定位，提高了蛋清蛋白的乳化性。而改性后乳化穩定性有所提高，是因為在乳狀液失去穩定性前會發生界面蛋白質膜的解析或形變，而不溶性的蛋白顆粒可以穩定已吸附的蛋白質膜，從而防止蛋白膜表面發生變化，起到穩定作用。

圖3 磷酸化改性對蛋清蛋白起泡性的影響Figure 3 The effect of phosphorylation on the foaming capacity of egg white

圖4 磷酸化改性對蛋清蛋白泡沫穩定性的影響Figure 4 The effect of phosphorylation on the foam stability of egg white

圖5 磷酸化改性對蛋白質乳化性及乳化穩定性的影響Figure 5 The effect of phosphorylation on the emulsification and emulsion stability of egg white

2.3 蛋清液蛋白磷酸化LF-NMR分析

蛋清是由水和大分子蛋白等構成的復雜凝膠體，水和蛋白分子間的相互作用是影響系統氫質子弛豫過程的最重要因素。在低場核磁共振體系中，不同的T2弛豫時間有其對應的組分，代表不同相態的氫質子。其中T21(0～10 ms)表示蛋白質分子表面的極性基團與水分子緊密結合的水分子層，T22(10～100 ms)表示存在于蛋白空間網狀結構之間的不易流動水，T23(100～1 000 ms)表示存在于蛋白結構外間隙中能自由流動的水。由圖6、7可知，磷酸化改性后蛋清不易流動水弛豫時間(T22)和自由水弛豫時間(T23)均發生明顯變化，不易流動水(T22)信號強度和峰面積均明顯增加，而自由水(T23)信號強度和峰面積明顯減小。說明在磷酸化改性后，蛋白質帶電量增加，斥力增大，蛋白質解聚，形成持水的空間網絡結構，維持了堅固的四級空間立體結構，對于水分的束縛作用增強，體系中的氫質子所受束縛力提高。

圖6 磷酸化前蛋清蛋白低場核磁圖Figure 6 L-NMR map of pre-phosphorylated egg white

圖7 磷酸化后蛋清蛋白低場核磁圖Figure 7 L-NMR map of egg white after phosphorylation

L-NMR結果表明，磷酸化改性后的蛋清蛋白持水性有所提高，蛋白質分子與水分子結合更加緊密，不易失水。

3 結論

(1) 利用STP對蛋清液進行磷酸化改性(反應pH 7.5，STP添加量4%，反應溫度40℃，反應時間4 h)，改性后蛋白磷酸化程度達到50.96 mg/g，并采用LF-NMR技術輔助觀察了蛋白質內部水分的遷移變化，結果表明磷酸化改性后雞蛋清液的功能性得到改善，這為拓展蛋白質的利用范圍及適應各類食品的生產開發提供了依據。

(2) 現有雞蛋清改性研究[23-24]多以噴霧干燥制備的蛋清粉為原料，本研究以蛋清液為原料，可最大程度地保留雞蛋清的各項功能特性，并節約生產成本。

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Study on phosphorylated modification and properties of pasteurized egg white

ZHANG Gen-shengLITing-tingDINGJianCHANGHong

WANGRuiCHITian-qiTANGMin

(CollegeofFoodEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)

Pasteurized egg white was used as raw material and modified by sodium tripolyphosphate (STP). The optimum conditions for the phosphorylation of egg white were determined by single factor and orthogonal test, for the reaction pH 7.5, the amount of STP 4%, the reaction temperature 40℃, and the reaction time 4 h. Under the optimal conditions, the degree of phosphoryl-ation reached 50.96 mg/g. The low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) was used to observe the binding of proteins to water during the process. The results showed that the solubility, water - holding capacity, foaming property and emulsifying property of egg albumin were all improved after phosphorylation.

egg white; pasteurized; sodium tripolyphosphate; phosphorylation degree; low field nuclear magnetic resonance

張根生(1964-)，男，哈爾濱商業大學教授，碩士。 E-mail：zhanggsh@163.com

2016—12—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.003