食品中農獸藥殘留生物傳感檢測技術的研究進展

李 芳,康懷彬,張瑞華,馬紅燕

(河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471023)

食品中農獸藥殘留生物傳感檢測技術的研究進展

李 芳,康懷彬*,張瑞華,馬紅燕

(河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471023)

由農獸藥殘留所引發的食品安全問題已受到社會各界的廣泛關注。生物傳感器具有特異性好、檢測快速,成本低等優勢,在農獸藥殘留檢測領域具有重要的應用價值。本文介紹了免疫傳感器、適配傳感器、酶傳感器在食品中農獸藥殘留檢測方面的應用,并對其未來的發展方向進行了展望。

農獸藥殘留,生物傳感器,食品安全

食品安全一直是全球關注的熱點,它與人類健康、經濟發展和社會穩定息息相關,是關系國計民生的重大問題。其中農獸藥殘留是影響食品安全的重要因素之一。為降低各種病蟲害疾病的影響,追求高產量,人類頻繁、超劑量使用各種農獸藥,加劇了食品中農獸藥殘留。若長期食用這些食品,可導致農獸藥在人體內的積累,產生蓄積毒性、細菌耐藥性等一系列連鎖問題,危及食用者身體健康。由于食品中的農獸藥殘留量一般都在微克到納克級別,基質又十分復雜,導致經典化學分析方法的應用受限。近年來,隨著現代分析技術的快速發展,許多快速、靈敏、高效的新技術在食品農獸藥殘留檢測領域嶄露頭角,彌補了傳統檢測方法的不足。

生物傳感技術就是其中一種日漸成熟的技術。與傳統方法比,生物傳感技術具有靈敏度高、選擇性好、成本低、檢測快速等特點,被廣泛應用于臨床診斷、環境檢測、食品分析等領域。特別是在食品中農獸藥殘留方面,傳統的微生物法耗時、復雜,特異性和靈敏度也難以保證,色譜法的樣品前處理過程復雜,測試時間長、費用高,儀器昂貴、移動性差,使用生物傳感器不僅可以獲得準確、靈敏的測試結果,同時操作簡便快捷,還可實現現場在線檢測,具有更廣闊的應用前景。本文對生物傳感器在食品中農獸藥殘留檢測中的應用研究進行了綜述性介紹。

1 生物傳感器簡介

根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)的定義,生物傳感器是以生物活性物質為生物識別元件,按照一定規律將生物識別元件所感受到的物理化學變化轉化成可識別的信號輸出。圖1是生物傳感器的結構示意圖。生物傳感器的生物識別元件可以是酶、抗原(抗體)、微生物、細胞、動植物組織、核酸等,它的信號轉化元件可以是光學元件(如光纖、表面等離子共振)、電化學電極、熱敏元件、壓電裝置(如石英微晶天平、表面聲波)等。采用不同的生物識別元件和不同的信號轉化元件可組成不同的生物傳感器,其基本原理大致為:待測物質與生物識別元件特異性結合,發生生物化學反應,產生的生物化學信息如光、熱等被相應的信號轉換器轉化為可以定量處理的電信號,再經儀表放大和輸出,從而得到了待測物濃度。根據生物識別元件的不同,可以將生物傳感器劃分成酶傳感器、免疫傳感器、DNA傳感器、微生物傳感器、細胞傳感器等。研究者利用這些不同的生物識別元件及識別機制,開發了許多可用于農獸藥殘留的生物傳感檢測方法。

圖1 生物傳感器結構示意圖Fig.1 Working principle diagram of a biosensor

2 生物傳感器在食品中農獸藥殘留檢測方面的應用

2.1 免疫傳感器

表1 電化學免疫傳感器對食品中農獸藥殘留的檢測Table 1 Detection of pesticide and veterinary drug residues in foods using electrochemical immunosensors

食品中的農獸藥殘留往往都是一些復雜的小分子物質,屬于半抗原,僅具有反應原性而無免疫原性,但當它偶聯了大分子載體(通常為蛋白質)后可獲得免疫原性,刺激機體產生特異性抗體。因此可以利用抗原抗體的特異性免疫識別作用,以抗原或抗體作為識別元件構建針對農獸藥殘留測定的免疫傳感器。

Liu[1]等采用倏逝波熒光免疫傳感器對水和乳制品中的磺胺二甲基嘧啶進行測定,檢測時長僅15 min,檢測限量為0.06 μg/L。Ho[2]等研究者以脂質體納米泡作為信號放大體系,采用小分子直接包被和熒光免疫分析結合的方式,構建了一種高靈敏的慶大霉素免疫傳感檢測方法。經過免疫識別反應,脂質體納米泡可固定到96孔板表面,隨后加入去污劑,釋放脂質體納米泡中包裹的熒光染料分子,通過熒光檢測器測定慶大霉素濃度。采用該方法,可檢測脫脂奶粉中慶大霉素殘留量為14.16 ng/mL。另外,Song[3]等研究者構建了一個高通量基于多色量子點標記的熒光免疫分析方法對鏈霉素、四環素、青霉素G進行測定,檢測限均低于5 fg/mL,與商業化的ELISA試劑盒相比,該方法的靈敏度與準確度都相對較高,可實現復雜樣品中多目標物的高通量測定。武會娟[4]等以氯霉素抗體為識別元件,利用生物素-鏈霉親和素連接體系,結合熒光技術和分子馬達技術構建了一個可用于氯霉素檢測的納米生物傳感器,最低可檢測到1×10-11mg/mL氯霉素。

使用電極作為換能元件的電化學免疫傳感器在食品中農獸藥殘留領域的研究十分活躍,表1列舉了部分應用實例。Sun[5]等研究者在利用層層組裝技術,在金電極表面固定了單克隆抗體,構建了一個卡巴呋喃無標記安培免疫傳感器。所獲得的電流響應與卡巴呋喃質量濃度在0.1～1.0×106ng/mL范圍內呈現良好線性關系,檢測限可達0.06 ng/mL,在實際樣品分析中也取得了令人滿意的結果。該傳感器還可通過簡單的浸泡破壞抗原-抗體的結合而再生,可重復使用7次而檢測靈敏度不降低。Zang[6]等以納米金簇作為放大載體構建了一個可用于檢測食品中氧氟沙星的雙放大電化學免疫傳感器,最低可檢測到0.03 ng/mL的氧氟沙星。李建龍[7]等利用吸附法將青霉素G抗體固定在納米金修飾的玻碳電極表面,制備了用于牛奶中青霉素G檢測的電化學免疫傳感器。此外,研究者還結合磁性分離技術優點,構建了一些以磁性微粒為載體的新型電化學免疫傳感器[8-15]。Garcia-Febrero[8]等研究者以磁性微球作為載體負載百草枯抗原,建立了對土豆樣品中百草枯殘留的電化學免疫傳感器,最低可檢測到(0.18±0.09) μg/L的百草枯殘留,取得了令人滿意的結果。

近年來,研究者還開發了一些基于其他信號轉換元件的免疫傳感器。Mishra[16]等研究者結合流動注射技術構建了一個電化學石英晶體納米天平傳感器，用于牛奶樣品中鏈霉素殘留測定。Conzuelo[17]等利用掃描電鏡和表面增強拉曼散射技術對牛奶中的磺胺嘧啶殘留進行了測定。張增福[18]等利用表面等離子體共振的生物光學傳感器對牛奶中的氨芐青霉素殘留進行了測定,最低檢測限達到50 ng/mL。宋洋[19]等構建了以亞胺硫磷多克隆抗體為識別元件的表面等離子體共振傳感器，對蘋果汁、桃汁、橙汁中的亞胺硫磷殘留進行多次測定,取得了令人滿意的檢測結果。

2.2 適配體傳感器

適配體(aptamer),又稱為化學抗體,是通過指數富集配體系統進化技術篩選出來的一段簡單的單鏈DNA或RNA片段,能夠與各種不同種類的分子發生特異性結合反應。它具有以下優點:可以在體外批量化學合成,并且合成準確、純度高、批次間差異小;易于修飾和保存;特異性好;分子量小、穩定性好。與免疫抗體/抗原蛋白相比,適配體更適合作為識別元件來構建生物傳感器。關于農獸藥殘留的適配體傳感檢測也成為一個研究熱點。

熒光適配體傳感器主要是基于適配體和目標物作用后產生的熒光偏振或熒光信號改變來實現對目標物的定量分析。國內,段諾[20]等研究者構建了一個基于熒光粒子(KGdF4:Tb3+)與氧化石墨烯熒光能量共振體系的適配體傳感檢測方法用于牛奶中的四環素殘留測定,所獲得的熒光強度與四環素的質量濃度0.5～100 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系(R2=0.993),檢測下限達到0.25 ng/mL。Alibolandi[21]等設計了一個基于CdTe量子點與石墨烯熒光能量共振體系的傳感檢測方法對氯霉素殘留進行測定,其檢測下限可達到98 pmol/mL。Song[22]等則利用納米金構建了一個熒光-比色雙傳感檢測方法對奶粉中氨芐西林殘留進行測定,檢測下限分別達到2 ng/mL和10 ng/mL,取得了令人滿意的測定結果。為了獲取更為靈敏的結果,一些研究者還將DNA循環放大技術與熒光分析技術相結合構建了高靈敏的可用于農獸藥殘留測定的適配體傳感檢測方法[23-24]。Ramezani[24]等研究者構建了一種新型的基于Exo III核酸外切酶和納米金的卡那霉素熒光循環放大檢測方法,其檢測下限可達到321 pmol/mL。

電化學適配體傳感器是另一種常用的適配體傳感檢測方法。由于構成適配體鏈的基本單元A、G、C和T(U)堿基的電氧化還原信號低,并且某些電化學調制不利于適配體親和性質的保持,因此電化學適配體傳感器往往采用功能性標記物(如電活性物質、酶、納米粒子等)以獲得定量檢測信號[25-28]。Yan[26]等研究者采用堿性磷酸酶作為標記物構建了目標響應電化學核酸適配體開關傳感器檢測蜂蜜中的氯霉素殘留,其檢測下限可達0.29 nmol/L。Hao[29]等研究人員則以ABEI標記物使用電致化學發光法對乳中氯霉素殘留進行了測定,其檢測靈敏度達到0.01 ng/mL。除此之外,一些研究者還通過測定適配體與目標物結合前后電化學信號變化以達到農獸藥殘留測定的目的。Chen[29]等將氨基修飾的四環素適配體共價結合在金電極表面,以鐵氰化鉀作為電子指示劑,構建了一個無標記型的四環素電化學適配體傳感器,只需15 min就可檢測出1.0 ng/mL四環素。Pei和Guo[30-32]等人在電極表面組裝由石墨烯或碳納米管等納米材料構成的復合薄膜,提高了適配體的組裝密度和電子傳遞速率,分別可檢測食品中0.42 pg/mL,3.7 pg/mL和0.87 nmo/L的卡那霉素。Fei[33]等構建了類似原理的啶蟲脒電化學適配體傳感器,可檢測到1.7×10-14mol/L的啶蟲脒殘留。Yang[34]等使用無標記型電化學適配體傳感器成功檢測了5.0×10-13mol/L萊克多巴胺殘留。Wang[35]將滾環擴增放大技術用于牛奶中氨芐西林殘留的高靈敏檢測,可檢測到1.09 pmol/L的氨芐西林殘留。

此外,Barahona[36]等構建了一個基于膠體金聚合物的表面增強拉曼適配體傳感器對馬拉松農藥進行測定,檢測限可達到3.3 μg/mL。

2.3 酶傳感器

酶傳感器是開發應用最早的傳感器類型。自1962年Clark等人提出酶電極的概念以來,酶傳感器就一直是研究的熱點。目前已經報道的酶傳感器有幾百種,已商業化的有十幾種,如葡萄糖氧化酶電極傳感器、生物需氧量測定儀等,可用于目標物的現場快速監測。在農獸藥殘留方面,研究較多的是基于酶抑制原理的乙酰膽堿酯酶類傳感器。乙酰膽堿是一種神經遞質,可被膽堿酯酶催化水解為乙酸和膽堿,反應式如下:

有機磷和氨基甲酸酯類農藥能模仿乙酰膽堿,與乙酰膽堿酯酶的活性部位發生不可逆的鍵合從而抑制酶活性,導致酶的活性降低,根據酶活性降低程度即可對抑制劑進行定量測定。據此,研究者開發了許多用于農獸藥殘留測定的酶傳感器。Guo[37]等研究者構建了一個基于納米金淬滅量子點熒光的酶傳感器用于蔬菜中甲胺磷農藥的測定。硫代乙酰膽堿酯酶可催化水解底物生成硫代膽堿,該物質能夠促使納米金聚沉,削弱納米金對CdTe量子點的淬滅,導致量子點熒光恢復。當有甲胺磷存在時,硫代乙酰膽堿酯酶活性受到抑制,量子點熒光未能恢復。CdTe熒光強度與甲胺磷濃度在0.06～0.78 mg/kg范圍內呈現良好的線性關系,檢測下限達到2 μg/kg。國內,關樺南[38]等制備了基于功能化多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶生物傳感器對不同濃度的氧化樂果進行測定。陳志剛[39]等設計了一種由絲網印刷酶電極、信號調節電路和單片機組成的便攜式農藥濃度現場快速測量裝置,可測定1.7 ng/mL的西維因,檢測過程僅需160.7 s。陳文飛[40]等人研究了一種聚硫堇修飾的一次性酶傳感器用于果蔬中辛硫磷農藥殘留測定。除此之外,一些研究者還利用能夠直接催化水解有機磷農藥的有機磷水解酶作為識別元件去構建一些傳感器。Khaksarinejad[41]將有機磷水解酶偶聯于磁性納米硅球表面,與熒光指示劑香豆素相結合制備了一種新型的生物傳感器。香豆素與有機磷水解酶結合生成的共軛化合物可以產生較強的熒光,當加入有機磷農藥時,有機磷水解酶的二級結構被破壞,共軛化合物的熒光減弱。基于該檢測原理,研究者對對氧磷農藥進行測定,檢測限達到5×10-6μmol/L。Zhang[42]等研究者則利用乙酰膽堿酯酶和有機磷水解酶構建了一個雙酶傳感器，同時檢測有機磷農藥對氧磷和非有機磷農藥西維因。

Chen[43]等研究者將碳納米管、蘇木精和β-內酰胺酶層層組裝于玻碳電極表面構成了一種電流型青霉素高敏酶傳感器。β-內酰胺酶催化水解青霉素可導致溶液pH變化,通過監測溶液的電流變化最低可檢測到19 μg/L的青霉素殘留量。Prado[44]等研究開發了一種基于β-內酰胺酶電化學傳感器用于牛奶中氨芐青霉素檢測,可檢測到0.079 μmol/L的氨芐青霉素。

3 結論與展望

本文介紹了生物傳感檢測技術在食品中農獸藥殘留測定方面的研究進展。生物傳感檢測是一門多學科交叉的高新技術,雖然起步較晚,但在農獸藥殘留測定領域發展較快,免疫傳感器、適配體傳感器、酶傳感器等各有優勢,近年來都得到了發展,但免疫傳感器主要受抗體的影響,如抗體制備的穩定性等因素;適配體傳感器受適配體的限制較大,目前已確定的抗生素適配體仍然非常有限,如何篩選高親和力的適配體序列還依賴于研究的深入和技術的進步;酶傳感器則受酶的種類和固定方法影響,檢測限較高,較多用于快速測量領域。總體來說,免疫傳感器和適配體傳感器的靈敏度、可靠性較好,具有較強的開發應用前景。未來,食品中農獸藥殘留生物傳感檢測技術的研究仍將集中在納米技術的應用、換能檢測方法的創新和改進,多通路自動化檢測方案的實現等方面。隨著各學科的飛速發展,各項研究的深入,生物傳感器在食品中農獸藥殘留檢測開發中遇到的困難也將迎刃而解。

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Development of biosensors for the detection of pesticide and veterinary drug residues in foods

LI Fang,KANG Huai-bin*,ZHANG Rui-hua,MA Hong-yan

(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

Due to serious side effects in human,pesticide and veterinary drug residues in foods are one of the important issues in food safety,which have attracted a great deal of public attentions. Owing to the virtues of their specificity,fast response and low cost,biosensors play an important role in the detection of pesticide and veterinary drug residues in foods. This paper was presented as an overview of applications of immunosensors,aptasensors and enzyme sensors for the analysis of pesticide and veterinary drug residues in foods. Possible future directions were also outlined.

pesticide and veterinary drug residues;biosensors;food safety

2016-07-20

李芳(1984-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全與檢測，E-mail：lifang182006@126.com。

*通訊作者:康懷彬(1963-)，男，碩士，教授，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail：khbin001@163.com。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31501563)；河南科技大學青年科學基金項目(2015QN030)。

TS201.6

A

:1002-0306(2017)04-0396-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.066