氨基葡萄糖、骨碎補和蝦青素對大鼠急性骨關節炎的干預研究

陳世杰,勞文艷,2,周艷麗,李艷梅,趙曉紅,2,*

(1.北京聯合大學功能食品科學技術研究院,北京 100191;2.北京聯合大學應用文理學院生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191;3.北京綠色金可生物技術股份有限公司,北京 100081)

氨基葡萄糖、骨碎補和蝦青素對大鼠急性骨關節炎的干預研究

陳世杰1,勞文艷1,2,周艷麗1,李艷梅3,趙曉紅1,2,*

(1.北京聯合大學功能食品科學技術研究院,北京 100191;2.北京聯合大學應用文理學院生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191;3.北京綠色金可生物技術股份有限公司,北京 100081)

目的:觀察氨基葡萄糖(Glucosamine,GLU)、骨碎補(Drynaria rhizome,DR)和蝦青素(Astaxanthin,AST)單獨和聯合干預對大鼠急性骨關節炎的影響及其差別,為研發對骨關節炎有預防和改善作用的功能性食品提供理論依據。方法:120只雄性SD大鼠隨機分為10組:空白對照組、模型對照組、陽性對照組和7個受試物組(GLU、DR、AST、GLU+DR、GLU+AST、DR+AST、GLU+DR+AST組),空白組和模型組灌胃給予蒸餾水(10 mL/kg),陽性對照組灌胃給予雙氯芬酸鈉(2 mg/kg),GLU、DR、AST的灌胃劑量分別為:1000、250、120 mg/kg。采用關節腔注射白陶土與λ-鹿角菜膠誘發大鼠關節炎,在實驗后的第1、3、5、7 d測量大鼠關節腫脹度,第7 d處死動物,取膝關節制作石蠟組織切片,觀察關節軟骨組織學病理變化,評價蛋白聚糖的減少程度,取滑膜用ELISA測定大鼠滑膜組織中IL-1β和TNF-α的水平。結果:與模型對照組相比,各受試物組大鼠膝關節腫脹度均有不同程度減小,其中變化較顯著的是GLU、DR、GLU+DR組(p<0.01);各受試物組組織病理學評分、滑膜組織中TNF-α和IL-1β含量均有不同程度的降低,其中變化較顯著的是GLU+DR、GLU+DR+AST、GLU、DR組(p<0.01)。結論:氨基葡萄糖、骨碎補對大鼠急性關節炎具有預防和保護作用,聯合作用效果更好,而蝦青素的作用效果相對差些。

氨基葡萄糖,骨碎補,蝦青素,骨關節炎,關節軟骨

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)為一種慢性退行性病變,系由于勞損、創傷、增齡、肥胖、遺傳等多種因素引起的關節軟骨退化損傷、軟骨下骨和關節邊緣反應性增生[1]。因其具有較高的發病率和致殘率而受到醫學界的普遍關注[2]。據研究估計,全世界范圍內大約有10%的男性、18%的女性和60%～65%的60歲以上的人群均患有癥狀性骨關節炎,并且80%的此類患者活動受限[3]。隨著社會人口的老齡化,OA的發病率也呈逐漸上升的趨勢,已成為我國一個重大的公共健康問題,對其進行深入研究刻不容緩[4]。

骨關節炎的發病機制尚不明確,臨床也缺乏根治措施,目前治療藥物以非甾體抗炎藥為主[5],其作用是減輕疼痛,并不能減慢和阻止OA的病理發展,長期使用可導致嚴重的胃腸道不良反應及其他并發癥[6]。近年來的研究發現,硫酸軟骨素[7]、氨基葡萄糖(GLU)、骨碎補(DR)和鹿茸多肽等植物提取物在一定程度上能夠減輕軟骨損傷,起到保護及修復軟骨,抑制OA病理進程的作用,且無明顯毒副作用。氨基葡萄糖是一種天然的氨基單糖,可刺激軟骨細胞合成蛋白聚糖以補充軟骨基質的流失,促進關節軟骨的修復[8],在一定程度上阻斷OA的病理進程[9-10]。骨碎補是水龍骨科多年生蕨類植物[11],能有效抑制關節滑膜細胞凋亡,促進關節軟骨組織形態的恢復[12]。蝦青素(AST)是類胡蘿卜素的衍生物,具有抗氧化、提高免疫力、抗骨質疏松等作用[13],可提高軟骨細胞抗炎能力,有效降低軟骨細胞的氧化損傷[14]。上述三種物質聯合作用于OA大鼠是否具有更強的治療和保護作用還少有報道,因此,本實驗選取這三種物質,研究它們單獨或聯合作用的效果,為進一步開展預防和治療OA的研究及開發具有保護功能的生物活性物質提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

SD雄性大鼠 120只,160～180 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF級動物房,許可證號:SYXK(京)2012-0031;基礎飼料 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2014-012;白陶土、λ-鹿角菜膠、氨基葡萄糖、番紅-O-固綠染料、伊紅、蘇木色精、雙氯芬酸鈉 Sigma,USA;水合氯醛 阿拉丁,上海;蝦青素、骨碎補提取物 北京綠色金可生物技術股份有限公司;甲醛溶液、無水乙醇、二甲苯、甲酸、KCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 北京化工廠;TNF-α、IL-1βELISA試劑盒 上海滬尚生物科技有限公司;石蠟 Leica,USA;病理級載玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司。

HZS-H恒溫水浴振蕩器 東聯電子技術開發有限公司,哈爾濱;多功能酶標儀 Thermo,美國;E220型生物顯微鏡、RM2245型半自動輪轉切片機、AUTOSTAINER XL型全自動染色機、EG1150HC型石蠟包埋機、HI1210型推片機、HI1220型烘片機 Leica,德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 大鼠隨機分成10組,按表1劑量稱取各組樣品后用無菌水稀釋至10 mL,按體質量比(10 mL/kg)灌胃給藥,每日1次,連續7 d?？瞻讓φ战M和模型對照組每日灌胃蒸餾水,體積與實驗組相同。

表1 實驗分組及劑量Table 1 Experiment grouping and dose

注:GLU+DR組為GLU和DR聯合干預組,GLU+AST組為GLU和AST聯合干預組,DR+AST組為DR和AST聯合干預組,GLU+DR+AST組為GLU、DR和AST聯合干預組。

1.2.2 模型建立 第1 d灌胃給予受試物或蒸餾水1 h后,采用關節腔注射白陶土與λ-鹿角菜膠誘發模型對照組、陽性藥物組及各受試物組大鼠急性關節炎[15],方法如下:動物經水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔注射麻醉后,常規消毒右后肢膝關節部位,然后用1 mL注射針穿過髕骨韌帶向膝關節腔內注入滅菌生理鹽水配制的質量體積比4%白陶土與2% λ-鹿角菜膠的混懸液0.1 mL,并緩慢曲伸關節持續5 min。

1.2.3 指標檢測方法

1.2.3.1 關節腫脹度測定 在造模后的第1、3、5和7 d,用游標卡尺測量每組大鼠左右膝關節橫向直徑(mm),按以下公式計算膝關節腫脹度(%)。

關節腫脹度(%)=(右腿膝關節直徑-左腿膝關節直徑)/左腿膝關節直徑×100

式(1)

1.2.3.2 組織病理學檢查及評分 實驗結束后大鼠經水合氯醛麻醉后處死,剪下右膝關節,置10%中性緩沖福爾馬林中固定,用5%甲酸-福爾馬林脫鈣后,石蠟包埋,切片。分別進行蘇木精-伊紅(HE)[16]和番紅-O-固綠(SOFG)[17]染色。本研究采用記分系統對關節軟骨、軟骨細胞數量和形態、關節軟骨中的蛋白多糖等4類病損進行分類記分,然后用總分綜合評價膝關節的組織病理改變程度,其評分標準見表2[18]。

表2 組織病理學評分標準(總分12分)Table 2 Histopathological scoring criteria(total score of 12 points)

表3 不同處理對大鼠關節腫脹度的影響(n=10)Table 3 Effects of different treatments on the degree of joint swelling in rats(n=10)

注:與空白組比較,##表示差異極顯著(p<0.01);與模型組比較,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01);表4、表5同。

1.2.3.3 ELISA測定大鼠關節滑膜組織細胞因子TNF-α、IL-1β水平 取關節滑膜組織,放入組織研磨器中,加入PBS(10 mL/g),制成勻漿,然后置于-20 ℃過夜。經過2次反復凍融處理以破壞細胞膜,于2～8 ℃、12000×g離心15 min取上清,用ELISA(酶聯免疫吸附法)檢測大鼠關節滑膜組織細胞因子TNF-α、IL-1β含量(詳細步驟參照說明書)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同處理對大鼠關節腫脹度的影響

觀察不同時間不同處理對大鼠關節腫脹度的影響,結果見表3。由表3可知,誘發大鼠右膝關節炎后第1、3、5和7 d,模型對照組大鼠關節腫脹度極顯著大于空白對照組(p<0.01),表明模型誘導成功;與模型對照組相比,雙氯芬酸鈉組和GLU組大鼠關節腫脹度均極顯著降低(p<0.01)。誘發關節炎后第3、5和7 d,與模型對照組相比,DR組和GLU+DR+AST組大鼠關節腫脹度明顯小于模型對照組(p<0.05)。GLU+DR組大鼠第5、7 d測量的關節腫脹度極顯著小于模型對照組(p<0.01)。DR+AST組大鼠第5 d測量的關節腫脹度明顯小于模型對照組(p<0.05)。AST和GLU+AST組大鼠關節腫脹度與模型對照組差異不顯著(p>0.05)。以上結果表明,各受試物均能減輕大鼠由關節炎引起的腫脹損傷,其中,GLU、DR單獨和聯合作用的效果更優,AST可能對關節腫脹損傷的作用效果不明顯。

2.2 不同處理對大鼠關節軟骨的病理學改變的影響

2.2.1 大鼠膝關節組織切片HE染色的組織病理學征象 由圖1可見,空白對照組大鼠關節軟骨表面光滑,完整,軟骨層無裂縫、侵蝕;軟骨細胞規則排列于軟骨陷窩內,呈柱狀排列,軟骨細胞數量、形態無異常。模型對照組大鼠關節軟骨表面粗糙、不平整,有垂直裂縫,可深達放射層及鈣化層,部分軟骨層脫落,大范圍骨侵蝕和軟骨破壞;表層內的軟骨細胞明顯減少,細胞排列紊亂,放射層細胞則增多明顯,鈣化層可見有大量肥大的軟骨細胞,有細胞團存在,部分有血管翳形成。陽性對照組大鼠組織病理學所見則明顯輕于模型組,表現為關節軟骨侵蝕較輕,細胞排列較規則,細胞增生減少。各組大鼠關節軟骨組織病理學征象均明顯輕于模型對照組,其中,GLU、GLU+DR、GLU+DR+AST、DR、DR+AST組大鼠組織病理學征象減輕較明顯,GLU+AST、AST組次之。以上結果提示,各受試物均能減輕大鼠關節軟骨組織病理學異常現象,其中,GLU、DR單獨和聯合作用的效果更優。

圖1 大鼠膝關節代表性組織病理學征象(HE染色,100×)Fig.1 Representative of histopathological features of knee joint in rats(stained with HE,100×)

表4 大鼠膝關節切片的組織病理學評分結果(n=10)Table 4 Histopathological scores of section of knee joint in rats(n=10)

2.2.2 大鼠膝關節組織切片SOFG染色的組織病理學征象 如圖2所示,空白對照組關節軟骨蛋白聚糖染色正常(顏色鮮紅且均勻);模型對照組關節軟骨基質中蛋白聚糖染色重度減退,說明造模后大鼠關節軟骨細胞外基質中蛋白聚糖含量明顯降低,模型誘導成功;與模型組相比,陽性對照組蛋白聚糖染色變化確實明顯小于模型組,各受試物組除GLU、DR組外,其他各組改善作用不明顯,可能是由于本實驗采用關節腔注射法造成大鼠膝關節急性損傷,短期內蛋白聚糖的變化不明顯。

圖2 大鼠膝關節代表性組織病理學征象(SOFG染色,100×)Fig.2 Representative of histopathological features of knee joint in rats(stained with SOFG,100×)

2.2.3 不同處理對大鼠關節軟骨組織病理學評分的影響 組織病理學評分結果(表4)顯示,模型對照組大鼠關節軟骨的各項組織病理學評分均極顯著高于空白對照組(p<0.01)。陽性對照組大鼠的各項組織病理學評分均顯著低于模型對照組(p<0.05)。GLU、GLU+DR、DR+AST和GLU+DR+AST組大鼠關節軟骨表面、軟骨細胞、總評分均顯著(p<0.05)小于模型對照組,蛋白聚糖評分與模型對照組間無明顯差別。DR組大鼠關節軟骨細胞、蛋白聚糖和總評分顯著(p<0.05)小于模型對照組,關節軟骨表面評分與模型對照組間無明顯差別。AST組大鼠關節軟骨表面和總評分顯著(p<0.05)小于模型對照組。GLU+AST組大鼠關節軟骨細胞和總評分顯著(p<0.05)小于模型對照組。由總評分可見,各受試物對組織病理學異?，F象均具明顯改善作用,除GLU+AST、AST具有顯著改善作用外,其他各受試物均具有極顯著的改善作用。

2.3 不同處理對大鼠關節滑膜組織TNF-α、IL-1β水平的影響

由表5可見,與空白對照組相比,模型對照組大鼠關節滑膜組織中TNF-α和IL-1β含量均極顯著(p<0.01)升高,說明誘發大鼠急性OA后,大鼠滑膜組織發生炎癥性改變,炎性因子TNF-α和IL-1β水平明顯升高。陽性對照組大鼠關節滑膜組織中TNF-α和IL-1β含量均極顯著(p<0.01)低于模型對照組。除AST組外,其余配方組TNF-α、IL-1β含量均極顯著(p<0.01)小于模型對照組。上述結果表明,除AST外,各受試物均能明顯降低大鼠關節滑膜組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平,對OA引起的大鼠關節滑膜炎癥具有良好的改善作用。

表5 不同配方對大鼠關節滑膜細胞因子TNF-α和IL-1β水平的影響(n=10)Table 5 Effects of different formula on synovial cytokine TNF-α and IL-1β in rats(n=10)

3 討論

良好的疾病模型是研究的基礎,更是實驗結論可靠性的保證[19]。骨關節炎動物模型的建立可以通過模擬一種或數種致病因素誘發關節軟骨退變來實現,其模型大致可分為自發模型和誘發模型兩大類[20]。自發性動物模型能較好地模擬發病過程,是研究OA發病機制、關節軟骨生化改變及防治效果的良好模型[21],但此類模型需要的動物數量大,實驗周期長,研究費用高,目前實際應用較少[22]。誘發性動物模型是指通過各種實驗性的干預措施來誘導骨關節炎的產生[21],主要有關節制動、關節腔注射[23]、寒冷刺激等模型以及關節內手術誘發模型(Hulth模型、關節劃痕、半月板或前交叉韌帶切除等)[24-25]、關節外手術誘發模型(改變關節應力、卵巢切除法等)[26-27]、飲食誘導模型[28]和運動性損傷模型[29]等。其中,關節腔注射法建模所需時間短,可模擬軟骨破壞的終末環節,適于軟骨病理、藥物和活性物質防治的研究,在藥物療效及活性物質篩選等方面優勢明顯,因此,本實驗采用關節腔注射法建立大鼠急性骨關節炎模型,通過關節腫脹度、滑膜組織炎性因子和組織病理學變化,研究氨基葡萄糖、骨碎補、蝦青素單獨或聯合干預對大鼠骨關節炎的影響。

通過關節腔注射白陶土與鹿角菜膠誘發大鼠急性骨關節炎后,大鼠膝關節持續腫脹,滑膜組織炎性因子TNF-α和IL-1β水平顯著升高,組織病理學檢查可見關節軟骨侵蝕、軟骨細胞數量和形態異常及軟骨蛋白聚糖染色缺失,表明模型誘導成功。灌胃給予大鼠各受試物后,大鼠關節腫脹損傷均有不同程度的緩解,滑膜組織炎性因子TNF-α、IL-1β水平降低,由骨關節炎引起的組織病理學異?，F象均得到改善。分析比較氨基葡萄糖、骨碎補、蝦青素單獨和聯合作用的結果,效果最好的是GLU+DR與GLU+DR+AST,其次是GLU與DR,進一步證明了氨基葡萄糖和骨碎補有較強的緩解關節腫脹,減輕滑膜炎癥,改善關節軟骨組織病理學異常的保護作用,且聯合作用效果更好,而蝦青素的保護作用相對要差一些。

4 結論

本實驗選用關節腔注射法建立大鼠OA模型,首次研究了GLU、AST、DR三種物質聯合作用對OA的干預效果,結果顯示,GLU、DR能明顯減小大鼠膝關節腫脹度,改善由OA引起的關節軟骨侵蝕、軟骨細胞數量和形態異常及軟骨蛋白聚糖缺失現象,并能明顯減輕滑膜炎癥,對大鼠急性OA具有一定的預防和保護作用,且聯合作用效果更好,而AST的作用效果相對要差一些。本研究的模型屬于急性模型,有待于建立合適的慢性模型,進一步研究這三種物質對慢性OA的干預效果以及研究三種物質在不同劑量下聯合作用的效果,為進一步開展預防和治療OA的研究及開發功能性食品提供科學依據。

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Intervention effects of glucosamine,drynaria rhizome and astaxanthin on acute osteoarthritis in rats

CHEN Shi-jie1,LAO Wen-yan1,2,ZHOU Yan-li1,LI Yan-mei3,ZHAO Xiao-hong1,2,*

(1.Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods,College of Applied Arts and Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China;2.Research Institute for Science and Technology of Functional Food,Beijing Union University,Beijing 100191,China;3.Beijing Gingko-group Biological Technology Co.,Ltd.,Beijing 100081,China)

Objective:To investigate and compare the individual and combined effects of glucosamine,astaxanthin,drynaria rhizome on acute osteoarthritis in rats,so as to provide theoretical basis for the development of functional foods with preventive and improvement effects on osteoarthritis. Methods:120 male SD rats were randomly divided into 10 groups:the control group,model group,positive group and 7 treatment groups(GLU,DR,AST,GLU+DR,GLU+AST,DR+AST,GLU+DR+AST group). The control and model group were orally given distilled water(10 mL/kg),the positive group received diclofenac sodium(2 mg/kg),the gavage dose of GLU,DR and AST was respectively 1000,250,120 mg/kg. The arthritis was induced by injecting the articular cavity with kaolin and carrageen-λ,the degree of joint swelling was measured on 1 th,3 th,5 th,and 7 th days after modeling. The knee joints were subjected to prepare paraffin tissue sections to observe the pathological changes of articular cartilage and to evaluate the reduction of proteoglycan. The contents of TNF-αand IL-1βin synovium were detected with ELISA kits. Results:Compared with model group,the swelling of the knee joint showed different degrees of reduction in each treatment group,the changes were more significant in GLU,DR and GLU+DR group(p<0.01).The histopathological score and the contents of TNF-αand IL-1βin synovium were decreased in different degrees in each treatment group,the GLU+DR,GLU+DR+AST and GLU DR group displayed a more significant reduction(p<0.01). Conclusion:GLU and DR had preventive and protective effects on acute osteoarthritis in rats,and the combined effect was better. While AST had relatively minimum effect.

osteoarthritis;glucosamine;drynariae rhizome;astaxanthin;articular cartilage

2016-08-12

陳世杰(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：生物活性物質的生理功能研究，E-mail:chenshijie5569@126.com。

*通訊作者:趙曉紅(1961-)，女，博士，研究員，研究方向：食品安全與功能學，E-mail:xiaohong@buu.edu.cn。

北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室開放課題(Zk70201501)。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)04-0365-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.061